研究背景 組織器官的缺血性損傷嚴重威脅人類的生命健康，其生存率低、預(yù)后差，成為臨床治療的一個難題。然而，傳統(tǒng)的治療方法難以從根本上恢復(fù)血管內(nèi)皮細胞的數(shù)量和功能，改善組織器官的血流灌注。再生醫(yī)學(xué)近二十年的發(fā)展涉及到生物學(xué)、材料學(xué)、工程學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等多學(xué)科，它為治療缺血性疾病提供了新的治療方法。尤其干細胞的研究，近十年取得的突破性進展為再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展帶來了新的機遇。將間充質(zhì)干細胞應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域治療各種缺血性疾病，正發(fā)揮著巨大的應(yīng)用潛力。目前，對于間充質(zhì)干細胞的應(yīng)用，主要以各種手段將其誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細胞，而誘導(dǎo)方法主要是通過干/祖細胞的基因修飾、藥物作用以及細胞因子的聯(lián)合運用等手段，盡管這些方法均可以成功實現(xiàn)誘導(dǎo)，但是他們所引起的過度分化問題引起了研究者的關(guān)注。對于具有無限分化潛能的間充質(zhì)干細胞而言，是否能通過改變細胞自身的某些性質(zhì)，達到提高干細胞誘導(dǎo)效率的目的。但是，目前尚無此類方法的報道。 隨著航天事業(yè)的發(fā)展，人們在空間科學(xué)領(lǐng)域的研究取得了一些創(chuàng)新成果，尤其在空間環(huán)境的微重力作用下，細胞的增殖凋亡和人體各系統(tǒng)功能均呈現(xiàn)了一定的改變。研究證明，微重力作用下細胞形態(tài)和功能改變與其所處的細胞內(nèi)環(huán)境息息相關(guān)。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，微重力刺激后BMSCs的形態(tài)由“長梭形”轉(zhuǎn)變?yōu)椤邦悎A形”，這種形態(tài)的改變具有什么意義呢？中醫(yī)學(xué)的“形神觀”闡明了人的形質(zhì)及由形質(zhì)構(gòu)成的形體與生命機能活動的密切聯(lián)系。形者神之質(zhì)，神者形之用，形態(tài)的變化與其功能的改變是統(tǒng)一的，必然會伴隨產(chǎn)生一系列生理或病理變化。微重力刺激后的BMSCs形態(tài)的圓形改變，可能是一種原始狀態(tài)的回歸，這種回歸將形態(tài)結(jié)構(gòu)有序與功能有序相統(tǒng)一，使干細胞處于形神相即的平衡環(huán)境中。在這種環(huán)境中，BMSCs自身是否具備了更強的分化潛能呢？其向內(nèi)皮細胞的分化能力又會發(fā)生什么樣的變化呢？微重力刺激后，細胞形態(tài)所呈現(xiàn)的變化影響細胞分化功能的調(diào)節(jié)機制又是什么呢？據(jù)此，我們進行了以下實驗研究。 目的： 1.研究BMSCs體外的培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記方法。 2.觀察體外條件下模擬微重力刺激對BMSCs向內(nèi)皮細胞分化的作用。 3.觀察模擬微重力刺激后的BMSCs移植對小鼠缺血下肢血管新生的作用。 4.通過觀察模擬微重力刺激后細胞形態(tài)的變化對細胞骨架的影響，探討骨架蛋白相關(guān)分子RhoA在BMSCs向內(nèi)皮細胞分化中的作用。 5.從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度解釋中醫(yī)理論，尋求細胞形態(tài)和功能統(tǒng)一性與中醫(yī)學(xué)“形神觀”的契合點。 方法： 1.采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，觀察細胞形態(tài)；采用MTT法檢測BMSCs的生長和存活能力；應(yīng)用流式細胞術(shù)鑒定細胞表面標(biāo)志性抗原CD29、CD34、CD45、CD90的表達；并將BMSCs分別用成脂和成骨培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)，采用油紅O和茜素紅染色鑒定分化后的細胞；凍存和復(fù)蘇BMSCs后，觀察其存活率和生長狀態(tài)；應(yīng)用DiI標(biāo)記BMSCs，觀察其標(biāo)記效果和對BMSCs生長狀態(tài)的影響。 2.將第3代BMSCs隨機分為空白對照組（control組）、正常重力培養(yǎng)組（NG組）、2D-clinostat刺激培養(yǎng)組（MMG組）；在微重力和正常重力刺激72h后，將細胞加入內(nèi)皮細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)6天，運用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，分別運用免疫熒光、流式細胞檢測、Real-time PCR、Western blot觀察誘導(dǎo)后內(nèi)皮樣細胞Flk-1、vWF的表達；ELISA法檢測血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維生長因子濃度；采用脂質(zhì)吞噬實驗和基質(zhì)膠血管形成實驗檢測正常重力和微重力刺激后BMSCs誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮細胞的功能。 3.制備小鼠股動脈結(jié)扎下肢缺血模型，將BMSCs分別進行微重力和正常重力刺激72h后應(yīng)用DiI標(biāo)記，于股動脈結(jié)扎術(shù)后1天進行干細胞移植。分別于術(shù)后第1d、第21d，使用激光多普勒灌注成像儀檢測患肢血流灌注恢復(fù)情況。術(shù)后21天，處死小鼠。免疫組化HE染色檢查組織損傷和修復(fù)情況；流式細胞儀檢測缺血肌肉中所含DiI陽性細胞數(shù)；免疫熒光雙染及Western blot檢測血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化效率及vWF的表達量。 4.將第3代BMSCs隨機分為正常重力組（0h組），微重力4h組（4h組）、微重力72h組（72h組）和微重力10d組（10d組）。采用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化；流式細胞儀檢測細胞凋亡；免疫熒光法檢測細胞骨架F-actin的變化。最后，免疫熒光法確定BMSCs中RhoA的定位，并構(gòu)建RhoA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染載體，驗證其轉(zhuǎn)染效率；將轉(zhuǎn)染成功后的BMSCs進行微重力72h刺激，并進行內(nèi)皮細胞的誘導(dǎo)，探討RhoA的活化和抑制對BMSCs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞標(biāo)志物Flk-1、vWF的表達、管腔形成的影響。 結(jié)果： 1.通過全骨髓貼壁方法培養(yǎng)的BMSCs貼壁生長，原代培養(yǎng)9～12d可傳代，傳代后增殖速度增快，P3代細胞已基本純化。P3代BMSCs呈紡錘形或長梭形，漩渦狀排列。經(jīng)流式細胞儀鑒定，表達CD29、CD90陽性，表達CD34、CD45陰性，符合BMSCs的特征；其能夠被誘導(dǎo)分化為脂肪細胞和成骨細胞；經(jīng)凍存和復(fù)蘇后的BMSCs生存率高，達90%和85%，且生長狀態(tài)良好；應(yīng)用DiI標(biāo)記BMSCs的有效率為100%，標(biāo)記72h后觀察發(fā)現(xiàn)其熒光顯色強度無明顯變化，且對BMSCs的生長狀態(tài)無影響。 2.微重力刺激72h后，加入內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)的BMSCs，可觀察到內(nèi)皮細胞標(biāo)志物Flk-1和vWF在免疫熒光檢測、流式細胞檢測、mRNA及蛋白水平的表達明顯高于正常重力組。DiI-Ac-LDL吞噬實驗、體外血管成形實驗的陽性結(jié)果也提示誘導(dǎo)后的細胞具備了內(nèi)皮細胞的功能。 3.對制備下肢缺血模型的小鼠進行微重力刺激后的BMSCs移植，在造模后第21天，與其它組比較，小鼠缺血后肢激光多普勒血流灌注圖像指數(shù)（LDPI index）改善最為明顯。免疫組化HE染色顯示微重力組細胞移植對缺血肢體的萎縮和肌肉的壞死損傷顯示出明顯的保護作用；流式細胞術(shù)檢測DiI陽性細胞數(shù)和免疫熒光雙染顯示，微重力組移植的BMSCs在體內(nèi)存活、分化為血管內(nèi)皮細胞的數(shù)目顯著高于正常重力組；缺血下肢中vWF在蛋白水平表達增加。 4.微重力刺激0h、4h、72h和10d后，BMSCs形態(tài)由梭形向類圓形轉(zhuǎn)變；流式細胞儀檢測各時間段細胞凋亡情況無明顯差異；免疫熒光檢測細胞骨架變化發(fā)現(xiàn)，微重力刺激72h時變化最明顯，微絲表達明顯下降，張力降低。而對于RhoA的表達發(fā)現(xiàn)其在BMSCs中主要分布于胞漿和胞膜上；通過構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方式，驗證了活化的RhoA可以促進內(nèi)皮細胞標(biāo)志物Flk-1和vWF的表達、管腔的形成，而沉默的RhoA則使BMSCs上述生物學(xué)行為受到抑制。 結(jié)論： 1.本實驗采用全骨髓貼壁法成功培養(yǎng)了大鼠BMSCs，并對其進行了分離、純化和擴增，還對其生物學(xué)特性和DiI標(biāo)記進行了初步研究。 2.微重力刺激后的BMSCs在體外向內(nèi)皮細胞的分化能力增強。 3.微重力刺激后的BMSCs移植具有更強的向內(nèi)皮細胞分化和促進血管新生的能力。 4.在微重力刺激72h時，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，RhoA可能通過調(diào)控細胞骨架解聚，從而促進其誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細胞和血管形成。 5.在中醫(yī)學(xué)“形神觀”中“形神合一”觀點指導(dǎo)下，微重力刺激后的BMSCs形態(tài)的圓形改變使其處于特殊條件下的回歸狀態(tài)中，這種回歸為干細胞自身提供了一種圓融、平衡的更適合其分化的環(huán)境，從而提高了BMSCs向內(nèi)皮細胞的分化能力。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R329
【部分圖文】：

管新生中的研究現(xiàn)狀皮細胞誘導(dǎo)分化的研究壁由內(nèi)膜、中膜和外膜三層組成。內(nèi)膜位于管壁的層兩層結(jié)構(gòu)。內(nèi)皮細胞襯附于血管內(nèi)，以其光滑的層為薄層的結(jié)締組織，具有維持血管壁收縮的作用性纖維兩層結(jié)構(gòu)，具有回縮擴張血管、維持張力作有修復(fù)能力。內(nèi)皮細胞在血管生成過程中主要通過樣結(jié)構(gòu)[19;20]，從而完成促進血管新生的作用(圖 1)十分有限。因此，為了產(chǎn)生血管樣結(jié)構(gòu)需要細胞不的內(nèi)皮細胞成為擺在研究者面前的一道難題。大家試圖通過干細胞的分化解決此問題。BMSCs 易于內(nèi)皮細胞，日益成為促進血管新生中理想的種子細

A（×100） B（×100）圖 1-1 BMSCs 細胞形態(tài)圖A 圖為 P0代 BMSCs，可見細胞形態(tài)各異，B 圖為 P3代 BMSCs，可見細胞形態(tài)均一，成旋渦狀分布。4.2 BMSCs 的生長曲線BMSCs 在傳代后增殖速度較原代明顯增快，一般在 7d 左右融合就可達到 8以上。細胞整體生長曲線呈 S 形：以 P3代細胞為例（圖 1-2），傳代后 1～2d 為伏期，3～6d 處于對數(shù)生長期，7～9d 進入平臺期。

A（×100） B（×100）圖 1-1 BMSCs 細胞形態(tài)圖A 圖為 P0代 BMSCs，可見細胞形態(tài)各異，B 圖為 P3代 BMSC可見細胞形態(tài)均一，成旋渦狀分布。Cs 的生長曲線Cs 在傳代后增殖速度較原代明顯增快，一般在 7d 左右融合就可胞整體生長曲線呈 S 形：以 P3代細胞為例（圖 1-2），傳代后 16d 處于對數(shù)生長期，7～9d 進入平臺期。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鄭紅斌;中醫(yī)形神觀源流與內(nèi)涵[J];浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2004年01期

2 何鳳;喻陸;童俊容;羅正茂;朱起之;王寅;張建林;;整合素連接激酶在梗阻性腎病腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中的作用及尿激酶對其表達調(diào)節(jié)的研究[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2009年05期

3 齊乃明;張文輝;高九州;霍明英;;空間微重力環(huán)境地面模擬試驗方法綜述[J];航天控制;2011年03期

4 張喜成;何延政;李躍武;劉勇;陳一塵;;補腎生血膠囊動員骨髓內(nèi)皮祖細胞促進缺血肢體血管新生的研究[J];江蘇中醫(yī)藥;2006年03期

5 劉承憲;21世紀空間生命科學(xué)和空間生物技術(shù)發(fā)展機遇與挑戰(zhàn)[J];空間科學(xué)學(xué)報;2000年S1期

6 李慧杰,李德新;淺釋中醫(yī)形神合一思想內(nèi)涵[J];遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2004年01期

7 張麗,紀立金;中醫(yī)學(xué)之形神理論及其應(yīng)用[J];遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2004年02期

8 郭新;漆正宇;秦潔;崔光輝;桂耀庭;蔡志明;;不同基質(zhì)蛋白對小鼠胚胎干細胞生殖細胞分化相關(guān)基因表達的影響[J];中華男科學(xué)雜志;2009年11期

9 張尚臣;圓道觀哲學(xué)思想與中醫(yī)臨證方法論[J];河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2005年02期

10 董建德;張建;谷涌泉;黃金洪;高峰;李春民;;脫細胞血管基質(zhì)的生物相容性研究[J];首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2010年05期

本文編號：2821645