研究背景 組織器官的缺血性損傷嚴(yán)重威脅人類的生命健康，其生存率低、預(yù)后差，成為臨床治療的一個(gè)難題。然而，傳統(tǒng)的治療方法難以從根本上恢復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量和功能，改善組織器官的血流灌注。再生醫(yī)學(xué)近二十年的發(fā)展涉及到生物學(xué)、材料學(xué)、工程學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等多學(xué)科，它為治療缺血性疾病提供了新的治療方法。尤其干細(xì)胞的研究，近十年取得的突破性進(jìn)展為再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展帶來(lái)了新的機(jī)遇。將間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域治療各種缺血性疾病，正發(fā)揮著巨大的應(yīng)用潛力。目前，對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，主要以各種手段將其誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞，而誘導(dǎo)方法主要是通過(guò)干/祖細(xì)胞的基因修飾、藥物作用以及細(xì)胞因子的聯(lián)合運(yùn)用等手段，盡管這些方法均可以成功實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)，但是他們所引起的過(guò)度分化問(wèn)題引起了研究者的關(guān)注。對(duì)于具有無(wú)限分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞而言，是否能通過(guò)改變細(xì)胞自身的某些性質(zhì)，達(dá)到提高干細(xì)胞誘導(dǎo)效率的目的。但是，目前尚無(wú)此類方法的報(bào)道。 隨著航天事業(yè)的發(fā)展，人們?cè)诳臻g科學(xué)領(lǐng)域的研究取得了一些創(chuàng)新成果，尤其在空間環(huán)境的微重力作用下，細(xì)胞的增殖凋亡和人體各系統(tǒng)功能均呈現(xiàn)了一定的改變。研究證明，微重力作用下細(xì)胞形態(tài)和功能改變與其所處的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境息息相關(guān)。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，微重力刺激后BMSCs的形態(tài)由“長(zhǎng)梭形”轉(zhuǎn)變?yōu)椤邦悎A形”，這種形態(tài)的改變具有什么意義呢？中醫(yī)學(xué)的“形神觀”闡明了人的形質(zhì)及由形質(zhì)構(gòu)成的形體與生命機(jī)能活動(dòng)的密切聯(lián)系。形者神之質(zhì)，神者形之用，形態(tài)的變化與其功能的改變是統(tǒng)一的，必然會(huì)伴隨產(chǎn)生一系列生理或病理變化。微重力刺激后的BMSCs形態(tài)的圓形改變，可能是一種原始狀態(tài)的回歸，這種回歸將形態(tài)結(jié)構(gòu)有序與功能有序相統(tǒng)一，使干細(xì)胞處于形神相即的平衡環(huán)境中。在這種環(huán)境中，BMSCs自身是否具備了更強(qiáng)的分化潛能呢？其向內(nèi)皮細(xì)胞的分化能力又會(huì)發(fā)生什么樣的變化呢？微重力刺激后，細(xì)胞形態(tài)所呈現(xiàn)的變化影響細(xì)胞分化功能的調(diào)節(jié)機(jī)制又是什么呢？據(jù)此，我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)研究。 目的： 1.研究BMSCs體外的培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記方法。 2.觀察體外條件下模擬微重力刺激對(duì)BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用。 3.觀察模擬微重力刺激后的BMSCs移植對(duì)小鼠缺血下肢血管新生的作用。 4.通過(guò)觀察模擬微重力刺激后細(xì)胞形態(tài)的變化對(duì)細(xì)胞骨架的影響，探討骨架蛋白相關(guān)分子RhoA在BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化中的作用。 5.從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度解釋中醫(yī)理論，尋求細(xì)胞形態(tài)和功能統(tǒng)一性與中醫(yī)學(xué)“形神觀”的契合點(diǎn)。 方法： 1.采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，觀察細(xì)胞形態(tài)；采用MTT法檢測(cè)BMSCs的生長(zhǎng)和存活能力；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原CD29、CD34、CD45、CD90的表達(dá)；并將BMSCs分別用成脂和成骨培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)，采用油紅O和茜素紅染色鑒定分化后的細(xì)胞；凍存和復(fù)蘇BMSCs后，觀察其存活率和生長(zhǎng)狀態(tài)；應(yīng)用DiI標(biāo)記BMSCs，觀察其標(biāo)記效果和對(duì)BMSCs生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。 2.將第3代BMSCs隨機(jī)分為空白對(duì)照組（control組）、正常重力培養(yǎng)組（NG組）、2D-clinostat刺激培養(yǎng)組（MMG組）；在微重力和正常重力刺激72h后，將細(xì)胞加入內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)6天，運(yùn)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，分別運(yùn)用免疫熒光、流式細(xì)胞檢測(cè)、Real-time PCR、Western blot觀察誘導(dǎo)后內(nèi)皮樣細(xì)胞Flk-1、vWF的表達(dá)；ELISA法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子濃度；采用脂質(zhì)吞噬實(shí)驗(yàn)和基質(zhì)膠血管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)正常重力和微重力刺激后BMSCs誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮細(xì)胞的功能。 3.制備小鼠股動(dòng)脈結(jié)扎下肢缺血模型，將BMSCs分別進(jìn)行微重力和正常重力刺激72h后應(yīng)用DiI標(biāo)記，于股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后1天進(jìn)行干細(xì)胞移植。分別于術(shù)后第1d、第21d，使用激光多普勒灌注成像儀檢測(cè)患肢血流灌注恢復(fù)情況。術(shù)后21天，處死小鼠。免疫組化HE染色檢查組織損傷和修復(fù)情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)缺血肌肉中所含DiI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)；免疫熒光雙染及Western blot檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率及vWF的表達(dá)量。 4.將第3代BMSCs隨機(jī)分為正常重力組（0h組），微重力4h組（4h組）、微重力72h組（72h組）和微重力10d組（10d組）。采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞骨架F-actin的變化。最后，免疫熒光法確定BMSCs中RhoA的定位，并構(gòu)建RhoA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染載體，驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效率；將轉(zhuǎn)染成功后的BMSCs進(jìn)行微重力72h刺激，并進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)，探討RhoA的活化和抑制對(duì)BMSCs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Flk-1、vWF的表達(dá)、管腔形成的影響。 結(jié)果： 1.通過(guò)全骨髓貼壁方法培養(yǎng)的BMSCs貼壁生長(zhǎng)，原代培養(yǎng)9～12d可傳代，傳代后增殖速度增快，P3代細(xì)胞已基本純化。P3代BMSCs呈紡錘形或長(zhǎng)梭形，漩渦狀排列。經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定，表達(dá)CD29、CD90陽(yáng)性，表達(dá)CD34、CD45陰性，符合BMSCs的特征；其能夠被誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞；經(jīng)凍存和復(fù)蘇后的BMSCs生存率高，達(dá)90%和85%，且生長(zhǎng)狀態(tài)良好；應(yīng)用DiI標(biāo)記BMSCs的有效率為100%，標(biāo)記72h后觀察發(fā)現(xiàn)其熒光顯色強(qiáng)度無(wú)明顯變化，且對(duì)BMSCs的生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)影響。 2.微重力刺激72h后，加入內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)的BMSCs，可觀察到內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Flk-1和vWF在免疫熒光檢測(cè)、流式細(xì)胞檢測(cè)、mRNA及蛋白水平的表達(dá)明顯高于正常重力組。DiI-Ac-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)、體外血管成形實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性結(jié)果也提示誘導(dǎo)后的細(xì)胞具備了內(nèi)皮細(xì)胞的功能。 3.對(duì)制備下肢缺血模型的小鼠進(jìn)行微重力刺激后的BMSCs移植，在造模后第21天，與其它組比較，小鼠缺血后肢激光多普勒血流灌注圖像指數(shù)（LDPI index）改善最為明顯。免疫組化HE染色顯示微重力組細(xì)胞移植對(duì)缺血肢體的萎縮和肌肉的壞死損傷顯示出明顯的保護(hù)作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DiI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和免疫熒光雙染顯示，微重力組移植的BMSCs在體內(nèi)存活、分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)目顯著高于正常重力組；缺血下肢中vWF在蛋白水平表達(dá)增加。 4.微重力刺激0h、4h、72h和10d后，BMSCs形態(tài)由梭形向類圓形轉(zhuǎn)變；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各時(shí)間段細(xì)胞凋亡情況無(wú)明顯差異；免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞骨架變化發(fā)現(xiàn)，微重力刺激72h時(shí)變化最明顯，微絲表達(dá)明顯下降，張力降低。而對(duì)于RhoA的表達(dá)發(fā)現(xiàn)其在BMSCs中主要分布于胞漿和胞膜上；通過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方式，驗(yàn)證了活化的RhoA可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Flk-1和vWF的表達(dá)、管腔的形成，而沉默的RhoA則使BMSCs上述生物學(xué)行為受到抑制。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁法成功培養(yǎng)了大鼠BMSCs，并對(duì)其進(jìn)行了分離、純化和擴(kuò)增，還對(duì)其生物學(xué)特性和DiI標(biāo)記進(jìn)行了初步研究。 2.微重力刺激后的BMSCs在體外向內(nèi)皮細(xì)胞的分化能力增強(qiáng)。 3.微重力刺激后的BMSCs移植具有更強(qiáng)的向內(nèi)皮細(xì)胞分化和促進(jìn)血管新生的能力。 4.在微重力刺激72h時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，RhoA可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞骨架解聚，從而促進(jìn)其誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞和血管形成。 5.在中醫(yī)學(xué)“形神觀”中“形神合一”觀點(diǎn)指導(dǎo)下，微重力刺激后的BMSCs形態(tài)的圓形改變使其處于特殊條件下的回歸狀態(tài)中，這種回歸為干細(xì)胞自身提供了一種圓融、平衡的更適合其分化的環(huán)境，從而提高了BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞的分化能力。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R329
【部分圖文】：

管新生中的研究現(xiàn)狀皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究壁由內(nèi)膜、中膜和外膜三層組成。內(nèi)膜位于管壁的層兩層結(jié)構(gòu)。內(nèi)皮細(xì)胞襯附于血管內(nèi)，以其光滑的層為薄層的結(jié)締組織，具有維持血管壁收縮的作用性纖維兩層結(jié)構(gòu)，具有回縮擴(kuò)張血管、維持張力作有修復(fù)能力。內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成過(guò)程中主要通過(guò)樣結(jié)構(gòu)[19;20]，從而完成促進(jìn)血管新生的作用(圖 1)十分有限。因此，為了產(chǎn)生血管樣結(jié)構(gòu)需要細(xì)胞不的內(nèi)皮細(xì)胞成為擺在研究者面前的一道難題。大家試圖通過(guò)干細(xì)胞的分化解決此問(wèn)題。BMSCs 易于內(nèi)皮細(xì)胞，日益成為促進(jìn)血管新生中理想的種子細(xì)

A（×100） B（×100）圖 1-1 BMSCs 細(xì)胞形態(tài)圖A 圖為 P0代 BMSCs，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)各異，B 圖為 P3代 BMSCs，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)均一，成旋渦狀分布。4.2 BMSCs 的生長(zhǎng)曲線BMSCs 在傳代后增殖速度較原代明顯增快，一般在 7d 左右融合就可達(dá)到 8以上。細(xì)胞整體生長(zhǎng)曲線呈 S 形：以 P3代細(xì)胞為例（圖 1-2），傳代后 1～2d 為伏期，3～6d 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，7～9d 進(jìn)入平臺(tái)期。

A（×100） B（×100）圖 1-1 BMSCs 細(xì)胞形態(tài)圖A 圖為 P0代 BMSCs，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)各異，B 圖為 P3代 BMSC可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)均一，成旋渦狀分布。Cs 的生長(zhǎng)曲線Cs 在傳代后增殖速度較原代明顯增快，一般在 7d 左右融合就可胞整體生長(zhǎng)曲線呈 S 形：以 P3代細(xì)胞為例（圖 1-2），傳代后 16d 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，7～9d 進(jìn)入平臺(tái)期。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2821645