骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)是腫瘤壞死因子受體超家族成員,它最主要的生物學(xué)作用是抑制體內(nèi)破骨細(xì)胞(osteoclast, OC)的分化、活化,并促進(jìn)其發(fā)生凋亡。臨床試驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,重組OPG蛋白和OPG基因治療等技術(shù)手段,對(duì)防治人及動(dòng)物的骨營養(yǎng)不良性疾病具有一定的應(yīng)用價(jià)值。但是關(guān)于OPG對(duì)OC的調(diào)控機(jī)制仍不完全清楚,對(duì)于OPG相關(guān)藥物的開發(fā)及其普遍運(yùn)用仍存在諸多困難。本文以原代分離鴨胚OC及誘導(dǎo)獲取OC模型為研究對(duì)象,在體外培養(yǎng)過程中添加不同濃度OPG,通過形態(tài)學(xué)鑒定、細(xì)胞活性檢測、實(shí)時(shí)熒光定量PCR (QRT-PCR)、蛋白免疫印跡(Western blot)等技術(shù)手段,研究OPG對(duì)OC分化、活性及凋亡中形態(tài)、功能、相關(guān)基因及關(guān)鍵信號(hào)蛋白的影響。本研究以期為OPG調(diào)控OC活性的機(jī)理提供理論依據(jù)。研究內(nèi)容如下： 1.OPG對(duì)破骨細(xì)胞分化、活化及凋亡的影響 為了研究OPG對(duì)體外培養(yǎng)鴨胚OC分化、活化與凋亡的影響,收集23日齡鴨胚骨髓細(xì)胞,體外培養(yǎng)過程中分組加入不同濃度OPG進(jìn)行處理(A組：無因子；B組：30ng/mL OPG; C組：100ng/mLOPG)。通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP),骨吸收陷窩分析,OC骨架(TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽,TRITC-conjugated phalloidin)及胞核(Hoechst33258)染色技術(shù),檢鋇TRAP陽性細(xì)胞、OC的骨吸收活性以及OC凋亡狀態(tài)。結(jié)果顯示,三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中TRAP陽性細(xì)胞數(shù)、OC的骨吸收活性均在OPG處理7d后達(dá)到最高水平。與對(duì)照組相比,OPG處理組OC數(shù)目及OC的骨吸收活性顯著減弱(P0.05),每個(gè)時(shí)間段骨吸收陷窩凈增長面積與OC數(shù)目變化趨勢一致。OPG能夠抑制OC內(nèi)纖維狀肌動(dòng)蛋白環(huán)(Filamentous-actin rings, F-actin rings)的形成,并且能夠促進(jìn)成熟OC內(nèi)F-actin環(huán)的崩解。此外,OPG能夠誘導(dǎo)成熟OC發(fā)生凋亡,OC的形態(tài)及核發(fā)生改變。表明OPG能夠抑制OC細(xì)胞前體分化,促進(jìn)成熟OC發(fā)生凋亡 2.OPG抑制破骨細(xì)胞分化成熟的機(jī)理 為了研究OPG抑制OC分化、活化的分子生物學(xué)機(jī)理,在無血清培養(yǎng)條件下,采用M-CSF+RANKL聯(lián)合誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化為OC。在培養(yǎng)過程中加入不同濃度OPG(0、10、20、50、100ng/mL)進(jìn)行處理。通過TRAP染色,OC內(nèi)F-actin環(huán)染色,骨吸收陷窩分析等技術(shù),研究OPG對(duì)OC的分化及活化的影響。此外,通過QRT-PCR技術(shù)檢測OPG對(duì)OC相關(guān)基因TRAP、RANK、MMP-9、CA Ⅱ、Cathepsin K表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示,在無血清培養(yǎng)條件下,M-CSF+RANKL能夠誘導(dǎo)OC的分化與活化,并能夠促進(jìn)OC分化及活化中TRAP、RANK、MMP-9、CAⅡ、Cathepsin K基因的表達(dá),而OC的分化與活化受到OPG的抑制。 3.OPG抑制破骨細(xì)胞分化成熟的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 為了研究OPG抑制OC分化中的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,采用M-CSF+RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化形成OC,在體外培養(yǎng)不同時(shí)間,各組分別添加相應(yīng)濃度的OPG。各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞,提取總蛋白,通過Western blot法檢測MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)蛋白的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),M-CSF+RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化形成OC過程中p38-MAPK、JNK-MAPK、ERK-MAPK三種蛋白的磷酸化水平均上升,在誘導(dǎo)處理15min后p38-MAPK磷酸化水平達(dá)最大值,誘導(dǎo)處理30min后JNK-MAPK、ERK-MAPK磷酸化水平達(dá)最大值。不同濃度OPG均能夠抑制p38-MAPK、JNK-MAPK、ERK-MAPK三種蛋白的磷酸化水平,且隨OPG濃度的增加抑制作用更加明顯。表明MAPK信號(hào)通路參與調(diào)控OC的分化與活化過程,且參與調(diào)控OPG抑制OC的分化與活化。 4.OPG抑制破骨細(xì)胞分化成熟的Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 為了研究OPG抑制OC分化中的Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,采用M-CSF+RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化形成OC,在體外培養(yǎng)不同時(shí)間,各組分別添加相應(yīng)濃度的OPG。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測OC胞內(nèi)[Ca2+]i,通過Western blot法檢測鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),M-CSF+RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化形成OC過程中OC胞內(nèi)[ca2+]i極顯著升高(P0.01),CaMKIⅠ激酶磷酸化水平上升,而OPG能夠降低OC胞內(nèi)[Ca2+]i,并下調(diào)CaMKIⅠ激酶的磷酸化水平。表明Ca2+信號(hào)通路參與調(diào)控OC的分化與活化過程,且參與調(diào)控OPG抑制OC的分化與活化。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：Q25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2821060