本文關(guān)鍵詞：含hTK1和hTIMP1雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建及對大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：本課題前期研究發(fā)現(xiàn)腺病毒介導(dǎo)的組織激肽釋放酶1（hTK1）基因過表達(dá)具有部分抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和改善血管再狹窄的作用，但聯(lián)合基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物（TIMP）對血管平滑肌細(xì)胞增殖是否具有協(xié)同效應(yīng)，目前尚不明了。本課題首先構(gòu)建含hTK1和hTIMP1雙基因共表達(dá)的重組腺病毒載體和含基因hTIMP1的重組腺病毒載體，并檢測病毒滴度。隨后觀察比較雙基因共表達(dá)載體與單基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）后，測定其感染率以及對血小板源性生長因子(PDGF-BB)誘導(dǎo)VSMCs增殖的影響。 方法： 第一部分： 1由Invitrogen公司購買含hTIMP1基因的原始質(zhì)粒，經(jīng)鑒定后，選擇相對應(yīng)內(nèi)切酶，酶切hTIMP1基因片段和含強(qiáng)綠色熒光蛋白基因（EGFP）穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP，經(jīng)連接熱激、轉(zhuǎn)化及構(gòu)建含hTIMP1和EGFP基因的重組穿梭質(zhì)粒，經(jīng)PCR、酶切和測序分析進(jìn)行鑒定。 2對含hTIMP1重組穿梭質(zhì)粒應(yīng)用限制性內(nèi)切酶BgⅢ/SaⅡ，進(jìn)行酶切并擴(kuò)增、回收含啟動子cmv的片段cmv-hTIMP1片斷，選擇對應(yīng)酶切位點同時酶切質(zhì)粒pDC316-hTK1載體（本研究室保存）并回收，并將上述產(chǎn)物進(jìn)行連接、熱休克法轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌DH-5ɑ后挑取正確克隆，構(gòu)建含雙啟動子和雙基因的重組穿梭質(zhì)粒。經(jīng)PCR、酶切分析和測序分析進(jìn)行鑒定該質(zhì)粒。 3將上述兩個重組穿梭質(zhì)粒線性化，并同腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxE1,3Cre轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，在293A細(xì)胞包裝含hTIMP1基因和hTK1和hTIMP1雙基因的重組腺病毒載體，并經(jīng)PCR鑒定毒種中的目的基因；以經(jīng)典TICD50法測定病毒滴度。 第二部分： 1組織塊貼壁法體外培養(yǎng)Sprague-Dawley (SD)大鼠胸主動脈VSMCs，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)并用Alpha Smooth Muscle Actin單克隆抗體經(jīng)細(xì)胞免疫組化法鑒定正確性。 2熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測重組腺病毒感染率。 3細(xì)胞計數(shù)法和四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法分別檢測細(xì)胞增殖改變。 結(jié)果： 第一部分： 1經(jīng)PCR法、雙酶切法和測序三種方法檢測證實，含hTIMP1和EGFP的重組穿梭質(zhì)粒pDC316-hTIMP1-EGFP,和含hTK1和hTIMP1基因的pDC316-cmv-hTK1-cmv-hTIMP1構(gòu)建正確。 2上述兩個重組穿梭質(zhì)粒分別與骨架質(zhì)粒pBHGloxE1,3Cre在293A細(xì)胞中成功包裝了含hTIMP1的Ad5-hTIMP1-EGFP重組腺病毒載體，和含hTK1和hTIMP1基因的Ad5-hTK1-hTIMP1重組腺病毒載體，并經(jīng)毒種PCR證實了目的基因正確性。 3經(jīng)TICD50法測定兩種重組腺病毒滴度：Ad5-hTIMP1-EGFP為7.0×1011vp/ml，Ad5-hTK1-hTIMP1為8.5×1011vp/ml。 第二部分： 1成功原代培養(yǎng)了大鼠VSMCs，細(xì)胞呈梭形、紡錘形，7-10天，細(xì)胞彼此融合，呈束狀排列，部分出現(xiàn)旋窩“峰和谷”樣的生長模式：經(jīng)細(xì)胞免疫組化鑒定胞漿內(nèi)a-SM免疫熒光陽性表達(dá)，呈紅色絲狀條紋，說明培養(yǎng)的細(xì)胞是血管平滑肌細(xì)胞，純度達(dá)95%以上，VSMCs純度高。 2Ad5-hTK1-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，感染率呈濃度（20-100MOI）和時間（1-4d）依賴性增加，在100MOI和第4天時最高感染率為99.57%；Ad5-hTIMP1-EGFP的感染率同樣呈濃度（20-150MOI）和時間（1-5d）依賴性增加，在150MOI和第5天時，最高感染率為98.14%。 3細(xì)胞計數(shù)法和MTT法結(jié)果顯示：與control組相比，，PDGF-BB可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(P0.01)；對照病毒組與單純PDGF-BB誘導(dǎo)組的細(xì)胞增殖無明顯差異；三種重組腺病毒Ad5-hTK1-EGFP、Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1呈時間(2-5d)依賴性和感染復(fù)數(shù)（20-150MOI）依賴性抑制PDGF-BB誘導(dǎo)VSMCs增殖；含雙基因腺病毒載體的抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于單基因腺病毒（Ad5-hTK1-EGFP和Ad5-hTIMP1-EGFP）（p0.01)，在第5天150MOI時的抑制率達(dá)50.97%。 結(jié)論： 1本研究通過雙啟動子策略，首次成功構(gòu)建和包裝含hTK1和hTIMP1雙基因的共表達(dá)重組腺病毒載體Ad5-hTK1-hTIMP1，同時成功構(gòu)建含hTIMP1的重組腺病毒載體Ad5-hTIMP1-EGFP； 2轉(zhuǎn)染VSMCs后，Ad5-hTIMP1-EGFP的感染率呈濃度（20-150MOI）和時間（1-4d）依賴性增加； 3雙基因共表達(dá)載體可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)VSMCs的生長和增殖，含雙基因（hTK1和hTIMP1）共表達(dá)載體的抑制效應(yīng)明顯大于單基因（hTK1或hTIMP1）載體，這為聯(lián)合基因在心血管的基因治療中奠定初步實驗基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：人組織激肽釋放酶-1 人基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1 重組腺病毒載體 血管平滑肌細(xì)胞 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 中英文縮略詞表4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 第一部分 含 hTK1 和 hTIMP1 基因的共表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建、滴度測定14-46
• 一 實驗材料14-15
• 二 主要試劑配制及準(zhǔn)備15-17
• 三 實驗方法17-30
• 四 實驗結(jié)果30-43
• 討論43-46
• 第二部分 雙基因共表達(dá)載體在大鼠血管平滑肌細(xì)胞的表達(dá)46-65
• 一 實驗材料46-47
• 二 實驗方法47-49
• 三 實驗結(jié)果49-61
• 討論61-65
• 結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 綜述70-74
• 參考文獻(xiàn)72-74
• 致謝74

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 郭艷紅,李黔,陳光慧,湯健,高煒;腺病毒介導(dǎo)的TIMP-4基因轉(zhuǎn)染抑制血管損傷后新生內(nèi)膜形成[J];北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2003年04期

2 姚曉軍;黃宗海;李強(qiáng);王朝陽;;Ad-VEGF-GFP-CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)對大腸癌的生長抑制作用及微環(huán)境中細(xì)胞因子活性的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2010年02期

3 張鑫;劉瀚e

本文編號：282140