本文關(guān)鍵詞：Notch信號(hào)對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）屬于成體干細(xì)胞，具有自我更新和多項(xiàng)分化潛能，已成為骨疾病治療及組織工程中的研究熱點(diǎn)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（bonemorphogenetic protein9，BMP9）是目前認(rèn)為BMPs家族誘導(dǎo)成骨能力最強(qiáng)的一種，但是對(duì)其誘導(dǎo)成骨分化的分子機(jī)制不甚清楚。Notch信號(hào)通路是生物體內(nèi)一較保守的信號(hào)通路，在生物體胚胎期及出生后發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的功能，調(diào)控著多種細(xì)胞的增殖和分化。同時(shí)，也有多項(xiàng)研究指出Notch信號(hào)通路參與了間充干（mesenchymal stemcells，MSCs）的成骨分化過程，對(duì)于骨骼系統(tǒng)的發(fā)育有著不可或缺的作用。課題組前期研究結(jié)果表明，Notch信號(hào)通路能夠協(xié)同BMP9促M(fèi)SCs成骨分化。本研究通過dnNotch1下調(diào)Notch信號(hào)通路，進(jìn)一步明確Notch信號(hào)對(duì)BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化影響（第一部分）；構(gòu)建能特異阻滯整個(gè)經(jīng)典Notch信號(hào)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Rbpj干擾腺病毒，擬進(jìn)一步確定其促進(jìn)成骨分化的作用和機(jī)制（第二部分）；由于重組腺病毒效果不穩(wěn)定，考慮可能有miRNA干擾，故通過生物信息學(xué)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討Notch相關(guān)miRNA mir133在BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的作用進(jìn)行了初步探討（第三部分）。 第一部分 Notch1信號(hào)對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究 目的：研究dnNotch1下調(diào)Notch后，，對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化的影響及可能機(jī)制。方法：利用顯性負(fù)性Notch1受體腺病毒載體（AdRdnNotch1）處理MEF細(xì)胞，采用活性測(cè)定、細(xì)胞化學(xué)染色分析早期成骨指標(biāo)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的變化； RT-PCR檢測(cè)晚期成骨指標(biāo)骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）的表達(dá)和下游靶基因的表達(dá)情況；Western和熒光素酶分別檢測(cè)BMP9經(jīng)典信號(hào)通路活化標(biāo)志p-Smad1/5/8蛋白和Smad結(jié)合元件（Smad-binding element，SBE）活性；結(jié)晶紫染色、流式細(xì)胞術(shù)分析其對(duì)細(xì)胞周期及凋亡影響；RT-PCR檢測(cè)BMP9下游靶基因的表達(dá)情況。結(jié)果：與對(duì)照組相比，AdRdnNotch1處理MEF后，與對(duì)照組相比，其3、5、7d后，ALP活性均有所降低（P＜0.05），并與AdRdnNotch1呈劑量依賴性；11d OPN和OCN表達(dá)量也有所下調(diào)（P＜0.05）；BMP9下游靶基因表達(dá)也受到了一定的抑制。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，BMPs經(jīng)典通路中Smad1/5/8總蛋白量沒有明顯變化，而p-Smad1/5/8蛋白表達(dá)水平及SBE活性也受到了一定的抑制（P＜0.05）；結(jié)晶紫及流式分析提示AdRdnNotch1能夠抑制BMP9誘導(dǎo)的早期細(xì)胞增殖，但不影響細(xì)胞凋亡。結(jié)論：AdRdnNotch1競(jìng)爭抑制Notch1信號(hào)后，BMP9誘導(dǎo)MEF的成骨能力顯著下降，其可能是通過抑制MSCs早期增殖和BMP信號(hào)通路的活化兩方面來抑制BMP9誘導(dǎo)的成骨分化進(jìn)程，進(jìn)一步提示Notch在BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨過程中發(fā)揮著重要的協(xié)同作用。 第二部分 攜帶siRbpj重組腺病毒載體的構(gòu)建及功能鑒定 目的：構(gòu)建能特異性干擾小鼠Rbpj基因的重組腺病毒AdsiRbpj，為進(jìn)一步研究Notch在骨發(fā)育和重建中的作用及其相關(guān)分子機(jī)制提供有用且實(shí)用的技術(shù)手段。方法：設(shè)計(jì)3對(duì)針對(duì)小鼠Rbpj基因的siRNA序列，將其分別亞克隆至pSES-HUS穿梭質(zhì)粒，再與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183內(nèi)同源重組獲得重組質(zhì)粒，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中包裝擴(kuò)增腺病毒，構(gòu)建好的AdsiRbpj與BMP9共處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2，利用RT-PCR、Western blot、組織化學(xué)和RT-qPCR進(jìn)行篩選、驗(yàn)證有效的干擾腺病毒。結(jié)果：初步篩選出干擾效果較好的AdsiRbpj-3，但是干擾效果不穩(wěn)定。結(jié)論：AdsiRbpj構(gòu)建未達(dá)到預(yù)期目的，考慮是否有受到miRNA等小RNA的干擾。 第三部分 Notch相關(guān)miRNA在BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化作用的初步探討 目的：探討Notch相關(guān)miRNA在BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化的作用。方法：在線軟件預(yù)測(cè)分析與Rbpj基因相關(guān)miRNA，qPCR檢測(cè)BMP9誘導(dǎo)MSCs（C3H10T1/2）成骨分化后Rbpj相關(guān)miRNA表達(dá)變化情況。結(jié)果：多個(gè)軟件提示可能與Rbpj基因結(jié)合的miRNA有mir133a、mir133b及mir21。qPCR證實(shí)BMP9能夠上調(diào)C3H10T1/2中mir133a、mir133b的表達(dá)量，下調(diào)mir21的表達(dá)量。在進(jìn)一步生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)， Notch信號(hào)通路中的共激活因子中的MAML1,3、共抑制因子中CTBP2和轉(zhuǎn)錄因子RBPJ基因上都有mir133作用位點(diǎn)。結(jié)論：mir133極有可能調(diào)控了Notch信號(hào)通路，但需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 Notch1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白9 Rbpj 成骨
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對(duì)照5-7
• 摘要7-12
• ABSTRACT12-16
• 前言16-20
• 參考文獻(xiàn)17-20
• 第一部分 Notch1 信號(hào)對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白 9 誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究20-44
• 1 材料與方法21-30
• 2 結(jié)果30-39
• 3 討論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 第二部分 攜帶 siRbpj 重組腺病毒載體的構(gòu)建及功能鑒定44-61
• 1 材料與方法44-50
• 2 結(jié)果50-57
• 3 討論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 第三部分 初步探討 Notch 相關(guān) microRNA 在 BMP9 誘導(dǎo)的 MSCs 成骨分化的作用61-70
• 1 材料與方法62-63
• 2 結(jié)果63-67
• 3 討論67-68
• 參考文獻(xiàn)68-70
• 全文總結(jié)70-71
• 文獻(xiàn)綜述71-78
• 參考文獻(xiàn)74-78
• 致謝78-79
• 碩士在讀期間發(fā)表論文題錄79-80

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本文編號(hào)：281948