本文關(guān)鍵詞：Notch信號對骨形態(tài)發(fā)生蛋白9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細胞成骨分化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）屬于成體干細胞，具有自我更新和多項分化潛能，已成為骨疾病治療及組織工程中的研究熱點。骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（bonemorphogenetic protein9，BMP9）是目前認(rèn)為BMPs家族誘導(dǎo)成骨能力最強的一種，但是對其誘導(dǎo)成骨分化的分子機制不甚清楚。Notch信號通路是生物體內(nèi)一較保守的信號通路，在生物體胚胎期及出生后發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的功能，調(diào)控著多種細胞的增殖和分化。同時，也有多項研究指出Notch信號通路參與了間充干（mesenchymal stemcells，MSCs）的成骨分化過程，對于骨骼系統(tǒng)的發(fā)育有著不可或缺的作用。課題組前期研究結(jié)果表明，Notch信號通路能夠協(xié)同BMP9促MSCs成骨分化。本研究通過dnNotch1下調(diào)Notch信號通路，進一步明確Notch信號對BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化影響（第一部分）；構(gòu)建能特異阻滯整個經(jīng)典Notch信號的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Rbpj干擾腺病毒，擬進一步確定其促進成骨分化的作用和機制（第二部分）；由于重組腺病毒效果不穩(wěn)定，考慮可能有miRNA干擾，故通過生物信息學(xué)和細胞實驗探討Notch相關(guān)miRNA mir133在BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的作用進行了初步探討（第三部分）。 第一部分 Notch1信號對骨形態(tài)發(fā)生蛋白9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細胞成骨分化的研究 目的：研究dnNotch1下調(diào)Notch后，，對骨形態(tài)發(fā)生蛋白9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化的影響及可能機制。方法：利用顯性負性Notch1受體腺病毒載體（AdRdnNotch1）處理MEF細胞，采用活性測定、細胞化學(xué)染色分析早期成骨指標(biāo)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的變化； RT-PCR檢測晚期成骨指標(biāo)骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）的表達和下游靶基因的表達情況；Western和熒光素酶分別檢測BMP9經(jīng)典信號通路活化標(biāo)志p-Smad1/5/8蛋白和Smad結(jié)合元件（Smad-binding element，SBE）活性；結(jié)晶紫染色、流式細胞術(shù)分析其對細胞周期及凋亡影響；RT-PCR檢測BMP9下游靶基因的表達情況。結(jié)果：與對照組相比，AdRdnNotch1處理MEF后，與對照組相比，其3、5、7d后，ALP活性均有所降低（P＜0.05），并與AdRdnNotch1呈劑量依賴性；11d OPN和OCN表達量也有所下調(diào)（P＜0.05）；BMP9下游靶基因表達也受到了一定的抑制。同時發(fā)現(xiàn)，BMPs經(jīng)典通路中Smad1/5/8總蛋白量沒有明顯變化，而p-Smad1/5/8蛋白表達水平及SBE活性也受到了一定的抑制（P＜0.05）；結(jié)晶紫及流式分析提示AdRdnNotch1能夠抑制BMP9誘導(dǎo)的早期細胞增殖，但不影響細胞凋亡。結(jié)論：AdRdnNotch1競爭抑制Notch1信號后，BMP9誘導(dǎo)MEF的成骨能力顯著下降，其可能是通過抑制MSCs早期增殖和BMP信號通路的活化兩方面來抑制BMP9誘導(dǎo)的成骨分化進程，進一步提示Notch在BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨過程中發(fā)揮著重要的協(xié)同作用。 第二部分 攜帶siRbpj重組腺病毒載體的構(gòu)建及功能鑒定 目的：構(gòu)建能特異性干擾小鼠Rbpj基因的重組腺病毒AdsiRbpj，為進一步研究Notch在骨發(fā)育和重建中的作用及其相關(guān)分子機制提供有用且實用的技術(shù)手段。方法：設(shè)計3對針對小鼠Rbpj基因的siRNA序列，將其分別亞克隆至pSES-HUS穿梭質(zhì)粒，再與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183內(nèi)同源重組獲得重組質(zhì)粒，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中包裝擴增腺病毒，構(gòu)建好的AdsiRbpj與BMP9共處理骨髓間充質(zhì)干細胞C3H10T1/2，利用RT-PCR、Western blot、組織化學(xué)和RT-qPCR進行篩選、驗證有效的干擾腺病毒。結(jié)果：初步篩選出干擾效果較好的AdsiRbpj-3，但是干擾效果不穩(wěn)定。結(jié)論：AdsiRbpj構(gòu)建未達到預(yù)期目的，考慮是否有受到miRNA等小RNA的干擾。 第三部分 Notch相關(guān)miRNA在BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化作用的初步探討 目的：探討Notch相關(guān)miRNA在BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化的作用。方法：在線軟件預(yù)測分析與Rbpj基因相關(guān)miRNA，qPCR檢測BMP9誘導(dǎo)MSCs（C3H10T1/2）成骨分化后Rbpj相關(guān)miRNA表達變化情況。結(jié)果：多個軟件提示可能與Rbpj基因結(jié)合的miRNA有mir133a、mir133b及mir21。qPCR證實BMP9能夠上調(diào)C3H10T1/2中mir133a、mir133b的表達量，下調(diào)mir21的表達量。在進一步生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)， Notch信號通路中的共激活因子中的MAML1,3、共抑制因子中CTBP2和轉(zhuǎn)錄因子RBPJ基因上都有mir133作用位點。結(jié)論：mir133極有可能調(diào)控了Notch信號通路，但需要進一步實驗證實。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細胞 Notch1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白9 Rbpj 成骨
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 摘要7-12
• ABSTRACT12-16
• 前言16-20
• 參考文獻17-20
• 第一部分 Notch1 信號對骨形態(tài)發(fā)生蛋白 9 誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細胞成骨分化的研究20-44
• 1 材料與方法21-30
• 2 結(jié)果30-39
• 3 討論39-40
• 參考文獻40-44
• 第二部分 攜帶 siRbpj 重組腺病毒載體的構(gòu)建及功能鑒定44-61
• 1 材料與方法44-50
• 2 結(jié)果50-57
• 3 討論57-58
• 參考文獻58-61
• 第三部分 初步探討 Notch 相關(guān) microRNA 在 BMP9 誘導(dǎo)的 MSCs 成骨分化的作用61-70
• 1 材料與方法62-63
• 2 結(jié)果63-67
• 3 討論67-68
• 參考文獻68-70
• 全文總結(jié)70-71
• 文獻綜述71-78
• 參考文獻74-78
• 致謝78-79
• 碩士在讀期間發(fā)表論文題錄79-80

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1 ;骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年10期

2 張利銘;李秋柏;李新建;陳智超;鄒萍;;不同代次骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化潛能的體外研究[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2012年02期

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4 朱灝,許建中,周強,王序全,單建林,趙敏,秦輝;不同年齡人骨髓間充質(zhì)干細胞體外增殖及成骨分化的研究[J];中國矯形外科雜志;2004年10期

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6 宋晉剛,許建中,周強,羅飛,李洪鵬;不同頻率脈沖電磁場誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的研究[J];中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志;2005年03期

7 ;骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年10期

8 張新昌;張西正;;骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化相關(guān)通路的研究進展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2013年21期

9 王浩;陳森;馬雨洪;姚惟琦;;降鈣素基因相關(guān)肽對滑膜來源間充質(zhì)干細胞增殖與成骨分化的調(diào)控作用[J];山東醫(yī)藥;2014年23期

10 郭惠蘭,謝東北,謝華,劉錫儀,黃紹軒;兔骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨分化對血管內(nèi)皮細胞形成的可能影響(英文)[J];中國臨床康復(fù);2005年10期

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1 鄭亮;鄭雅元;崔燎;劉鈺瑜;;四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的作用及機制研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2013年

2 吳江;陳槐卿;K-LP.SUNG;;鈦顆粒負荷影響骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化能力的機理[A];全國首屆青年復(fù)合材料學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2007年

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4 袁風(fēng)紅;鄒耀紅;高愷言;俞可佳;;地塞米松對體外人骨髓基質(zhì)細胞增殖及成骨分化的影響[A];全國自身免疫性疾病專題研討會暨第十一次全國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2006年

5 陳海嘯;洪盾;萬曉晨;李繼承;;腸毒素C聯(lián)合維生素C對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響研究[A];2008年浙江省骨科學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2008年

6 宋忠臣;束蓉;董家辰;李松;;低氧對牙周膜成纖維細胞增殖和成骨分化的影響[A];第十次全國牙周病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2014年

7 董家辰;束蓉;宋忠臣;;炎癥微環(huán)境對人牙周膜成纖維細胞增殖與成骨分化的影響[A];第十次全國牙周病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2014年

8 孫楠;楊力;張振;張樺;陳宏;蔡德鴻;;晚期氧化蛋白產(chǎn)物對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及向成骨分化的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第十二次全國內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2013年

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1 楊勇;電磁場促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化及初步機制[D];華中科技大學(xué);2010年

2 王琪;雌激素受體-α在骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達及對成骨分化影響的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2007年

3 湯郁;SLE患者骨髓MSC成骨分化機制研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2011年

4 江n;低強度脈沖超聲波對大鼠脂肪干細胞增殖和成骨分化的影響及成骨機制的初步研究[D];華中科技大學(xué);2012年

5 張麗俠;替諾福韋酯對人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響及其機制探討[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

6 洪盾;成骨分化中糖皮質(zhì)激素信號通路的研究[D];浙江大學(xué);2011年

7 蔡川;雌激素相關(guān)受體α對牙周膜干細胞成骨分化的調(diào)控作用研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

8 陳志信;成骨生長肽（10-14）對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成脂、成骨分化的影響[D];蘭州大學(xué);2007年

9 劉玉侃;納米相羥基磷灰石對骨髓間充質(zhì)干細胞生長及成骨分化的影響[D];浙江大學(xué);2008年

10 劉立躍;流體剪切力影響人骨髓間充質(zhì)干細胞分化的機制研究[D];浙江大學(xué);2011年

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1 侯秋科;維生素D受體介導(dǎo)龜板誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨分化[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2010年

2 王建國;成骨生長肽及其誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化機制的研究[D];山東大學(xué);2008年

3 洪亮;鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化中早期基因表達的實驗研究[D];暨南大學(xué);2009年

4 王志平;脈沖電磁場對脫鈣骨基質(zhì)誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞增殖與成骨分化的影響[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2010年

5 武成聰;短期凍存兔骨髓間充質(zhì)干細胞對其增殖及成骨分化潛能的影響[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2014年

6 黃國濤;摻鍶羥基磷灰石誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞成骨分化的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2009年

7 楊柳;β-TCP三維灌注生物反應(yīng)器用于骨髓間充質(zhì)干細胞擴增及成骨分化研究[D];上海交通大學(xué);2008年

8 尚國偉;小鼠骨髓間質(zhì)干細胞成骨分化及促腎上腺皮質(zhì)激素的影響[D];鄭州大學(xué);2014年

9 張金康;雙基因轉(zhuǎn)染對大鼠骨髓基質(zhì)干細胞增殖和成骨分化的影響[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

10 張啟;宿主免疫排斥對同種異體EGFP-BMSCs存活和成骨分化影響的實驗研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2009年

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本文編號：281948