DNA甲基轉移酶是一種在原核和真核生物高度保守的酶,能夠在基因組中的DNA復制后對其胞嘧啶C5位點進行修飾,參與體內多種重要生理過程,主要包括:調節(jié)基因表達、基因印記、維持染色體完整性以及X-染色體滅活等。根據(jù)其結構和功能的不同,哺乳動物中DNA甲基轉移酶(Dnmts)主要分為兩大類: DNA甲基化維持酶Dnmt1以及DNA從頭甲基化酶Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L等. 樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是指具有樹枝狀突起和星狀多形性，高表達MHCI類和I類分子，能有效攝取、加工和處理抗原并激活初始型T細胞的一類抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)。DC是1973年由Steinman和Cohn首先發(fā)現(xiàn)的。作為目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的APC，DC最大的特點是能夠刺激初始型T細胞(naive Tcell)活化和增殖。DC是抗原特異性免疫應答的始動者，由于其在免疫應答中的獨特地位，對DC的研究有助于深入了解機體免疫應答的產(chǎn)生和調控機制，對腫瘤、移植排斥、感染、自身免疫性疾病等的發(fā)生發(fā)展機制的認識有重要的理論意義。 免疫球蛋白超家族含有眾多的膜上和膜內受體,參與天然免疫和獲得性免疫中的各種免疫應答反應.小鼠CMRF-35樣分子家族為免疫球蛋白超家族的成員之一.CLM家族成員在識別不同的配體后能夠正向或負向調控免疫應答反應。本實驗室通過小鼠樹突狀細胞cDNA文庫大規(guī)模測序后，發(fā)現(xiàn)了一系列選擇性地在樹突狀細胞和巨噬細胞等抗原提呈細胞上表達的CLM家族成員受體，包括樹突狀細胞來源的免疫球蛋白受體1(DC-derived Ig receptor1, DIgR1)/CLM-4,樹突狀細胞來源的免疫球蛋白受體2(DC-derived Ig receptor2, DIgR2)/CLM-1, CLM-5，以及本文中研究的CLM-3。 抗原遞呈細胞能夠通過模式識別受體(pattern recognition receptors, PRR)識別病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)來檢測入侵宿主的病原微生物，然后促發(fā)免疫球蛋白超家族含有眾多的膜上和膜內受體,參與天然免疫和獲得性免疫中的各種免疫應答反應�；罨奶烊幻庖呒毎軌蛘T導促炎因子和I型干擾素的產(chǎn)生來清除入侵的病原微生物。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)作為模式識別受體中最重要的一種，顯著高表達于抗原遞呈細胞，包括巨噬細胞，單核細胞以及樹突狀細胞。根據(jù)所有TLRs家族成員的亞細胞定位，TLRs分成兩大類：細胞膜定位的TLRs和細胞內定位的TLRs。在所有TLRs中，內體定位的TLR9是唯一一種能夠識別病原體來源DNA的TLR。一旦結合細菌中含有CpG島的DNA或者人工合成的含有為甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)，TLR9就能夠直接活化抗原遞呈細胞和天然免疫細胞分泌各種促炎因子。當CpG-ODN結合到TLR9時能夠招募接頭分子MyD88，進而激活下游MAPKs和NF-κB的磷酸化信號通路，最終引起促炎因子和I型干擾素的產(chǎn)生。研究證實TLR9的激動劑能夠誘導強烈的Th1型免疫反應來保護宿主免受細菌和病毒的感染。因此，對于如何選擇性的活化TLR9信號來起始保護性免疫應答及TLR9完全活化的潛在機制仍需進一步研究。 基于以上研究進展和現(xiàn)狀分析，我們利用現(xiàn)代實驗技術對人單核細胞來源的樹突狀細胞和小鼠腹腔巨噬細胞中的DNMT1在天然免疫應答方面的功能進行了研究；同時對于CLM-3對于Toll樣受體的功能影響進行了深入的探討。 第一部分人單核細胞來源的樹突狀細胞中與DNMT1相互作用蛋白的探討 隨著小鼠骨髓來源樹突狀細胞在免疫應答中功能研究的深入，我們開始關注人單核細胞來源的樹突狀細胞的功能。作為重要的DNA甲基轉移酶DNMT1功能的不斷發(fā)現(xiàn)，使得我們開始探尋DNMT1在人單核細胞來源樹突狀細胞中的作用。 我們使用蛋白質免疫共沉淀技術、質譜兼容銀染以及LS-MS/MS的手段，發(fā)現(xiàn)了一系列在人單核細胞來源的樹突狀細胞中與DNMT1相互作用的蛋白，這些蛋白主要集中在翻譯起始因子eIF家族，主要包括eIF3A、eIF3H；以及細胞周期和凋亡調節(jié)蛋白1（cell cycle and apoptosis regulator protein1, CARP1)。 鑒于目前的研究報道，DNMT1主要是在核內發(fā)揮其對DNA的甲基化修飾功能，而eIF3A和eIF3H則主要是在胞漿中發(fā)揮蛋白的翻譯。這就促使我們去探尋DNMT1是否在胞漿中也發(fā)揮其非經(jīng)典功能，而參與了其他一些生物學功能。通過免疫共沉淀，我們發(fā)現(xiàn)了DNMT1確實存在于胞漿中，而且能夠與同在胞漿中發(fā)揮作用的eIF3A和eIF3H相互結合，而在胞核中則為發(fā)現(xiàn)eIF3A和eIF3H與DNMT1的結合。對于DNMT1在胞漿中具體發(fā)揮怎么樣的功能還有待于進一步的深入探討。 對于同期發(fā)現(xiàn)的細胞周期和凋亡調節(jié)蛋白CARP1，研究發(fā)現(xiàn)DNMT1與CARP1兩者之間主要在細胞核內相互作用，這提示我們CARP1可能參與了DNMT1的經(jīng)典功能，作為一個新的可能參與DNA甲基化的蛋白，其具體功能有待于進一步深入的研究。 第二部分DNMT1在巨噬細胞天然免疫功能中的作用研究 TLR是研究最早的模式識別受體，其在激活機體的固有免疫應答和調控獲得性免疫應答，抵御各種病原體感染中發(fā)揮重要的作用。它的活化不足導致機體不能有效地清除病原體，而過度的激活又會引發(fā)一系列的免疫損傷如膿毒癥休克等。因此TLR信號通路必須受到嚴格的精密調控，TLR信號通路同其他信號通路之間的交叉聯(lián)系也是近年來免疫學的研究熱點之一。 對于DNA甲基轉移酶DNMT1在TLR信號通路中的作用還沒有相關的研究報道，我們通過干擾小鼠腹腔巨噬細胞中的DNMT1后，用各種TLR配體進行刺激，進而研究DNMT1是否參與TLR信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，在DNMT1得到有效干擾后并不能夠顯著影響TLR3、TLR4以及TLR9活化產(chǎn)生的IFN-beta和TNF-alpha。 基于巨噬細胞在抗病毒的過程中也發(fā)揮著重要作用，我們觀察了干擾DNMT1對于VSV和SeV感染的影響。研究發(fā)現(xiàn)DNMT1的干擾能夠影響VSV和SeV引起的IFN-beta的產(chǎn)生，DNMT1能夠促進IFN-beta的產(chǎn)生，這提示我們DNMT1可能參與RIG-I的信號通路，對于其具體機制，有待于進一步的研究和探索。 第三部分CLM-3調控TLR9觸發(fā)的巨噬細胞天然免疫功能及其機制研究 CLM-3(CMRF-35like molecule3)作為CLM家族成員之一，與CLM-5關系密切，同屬于活化性受體。研究表明CLM-5能夠通過與含有免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine based-activating motif， ITAM)的FcRγ相互作用，進而轉導活化信號。CLM-3同樣也能夠與FcRγ相互作用，但是其在天然免疫應答中的功能還未得到確認。 本實驗室早期的研究發(fā)現(xiàn)CLM-3選擇性地表達于巨噬細胞中，CLM-3能夠通過與MyD88結合以激活MAPK、NFkB通路從而促進了TLR9觸發(fā)的巨噬細胞產(chǎn)生炎性細胞因子TNFa和IL-6，研究提示，CLM-3與帶有ITAM基序的FcRγ相互作用,但是，CLM-3調控TLR9信號通路的具體分子機制尚不清楚。 通過研究證實，CLM-3選擇性地表達于巨噬細胞中，為內體/溶酶體定位的免疫受體；在TLR9配體CpG-ODN刺激下，CLM-3在巨噬細胞中的表達被下調；CLM-3作為一個能夠在巨噬細胞中正向調控TLR9信號轉導的受體，主要通過增強TRAF6(TNFR-associated factor6)的泛素化，進而促進下游MAPKs和NF-κB的信號轉導，最終使得TLR9引發(fā)的天然免疫應答反應全面活化。研究主要發(fā)現(xiàn)通過與CLM-3的交互作用能夠促進TLR9引發(fā)的天然免疫反應，最終有利于宿主清除外來入侵病原體。 我們通過激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)在Raw264.7細胞系中CLM-3能夠與LAMP1陽性的細胞器和早期內體標記Rab5共定位，而對于高爾基體的代表性標記GM130則沒有明顯共定位。因此，CLM-3不像其他細胞膜定位的CLM家族成員，而是選擇性的定位于膜類細胞器內體及溶酶體。從CLM-3在巨噬細胞中定位內體及溶酶體，我們推測CLM-3可能在TLR9觸發(fā)的巨噬細胞活化過程中發(fā)揮作用。我們用CpG-ODN刺激siRNA干擾過的原代腹腔巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)CLM-3被干擾后降低TLR9活化引起的TNF-α和IL-6表達，但是不影響Poly(I:C)或LPS引起的TNF-α和IL-6的表達。因此，我們證實CLM-3能夠選擇性地促進TLR9，而非TLR3或TLR4，引起的促炎因子的產(chǎn)生。 為驗證CLM-3過表達在體內的作用,我們制備了CLM-3轉基因小鼠(CLM-3transgenic mice, CLM-3TG mice)觀察CLM-3在TLR9觸發(fā)的天然免疫應答。Westernblot證實在原代腹腔巨噬細胞中高表達帶HA標簽的CLM-3。取自CLM-3TG mice的巨噬細胞相較于同窩未表達HA-CLM-3的小鼠的巨噬細胞，在CpG-ODN刺激后能夠產(chǎn)生更多的TNF-α和IL-6，實驗結果和在巨噬細胞中過表達CLM-3的效應相一致。在小鼠腹腔注射CpG-ODN后，觀察血清中TNF-α和IL-6的表達水平也得出相似的結論，CLM-3TG mice較同窩對照小鼠產(chǎn)生更多的炎癥因子。鑒于在漿樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)中TLR9在I型干擾素的產(chǎn)生過程中發(fā)揮著重要作用，我們觀察了從轉基因小鼠脾臟來源的pDC在GpG-ODN刺激后誘導產(chǎn)生I型干擾素中的效應。研究發(fā)現(xiàn)CLM-3轉基因小鼠和同窩對照小鼠來源的pDC在干擾素的產(chǎn)生上并無顯著性差異。研究證實CLM-3作為一個能夠正向調控TLR9觸發(fā)的天然免疫應答主要在巨噬細胞中發(fā)揮作用。 已有研究報道證實，MAPKs和NF-κB是CpG-OND觸發(fā)細胞因子產(chǎn)生的關鍵信號通路。在CLM-3轉基因小鼠來源的巨噬細胞中，我們觀察到CLM-3的過表達能夠促進ERK1/2，JNK1/2，以及p38的磷酸化水平，相同的作用趨勢發(fā)現(xiàn)在CLM-3過表達的Raw264.7細胞系中。在體外檢測CLM-3轉基因小鼠來源的腹腔巨噬細胞發(fā)現(xiàn)CpG-ODN刺激活化IKKα/β和IκBα的磷酸化水平明顯強于同窩對照小鼠。上述實驗結果證實，CLM-3能夠促進CpG-ODN觸發(fā)的TLR9信號通路活化。 通過前面的實驗我們已經(jīng)證實了CLM-3對于TLR9的正向調控作用，對于潛在的機制研究將使我們對于CLM-3的了解更為透徹。報道證實，CpG-ODN在結合到TLR9后，下游信號分子MyD88能夠招募IRAK1(IL-1receptor associated kinase1)、IRAK2以及IRAK4。這些IRAK激酶的活化能夠招募TRAF6進行泛素化，進而激活下游的MPAKs和NF-κB信號。TRAF6作為TLR9信號中起關鍵作用的分子，其泛素化是激活下游信號活化所必需的。因此，我們想證實一下CLM-3的過表達是否會增強TRAF6的泛素化。在原代腹腔巨噬細胞中用siRNA干擾CLM-3后，我們檢測了CpG-ODN刺激后TRAF6的泛素化水平，發(fā)現(xiàn)CLM-3的沉默能夠降低TRAF6的泛素化水平。同理，我們檢測了來自于CLM-3轉基因小鼠的原代腹腔巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)CpG-OND刺激后，來自CLM-3轉基因小鼠的腹腔巨噬細胞中的TRAF6的泛素化水平高于同窩對照小鼠來源的。 在前面的研究中，我們證實了CLM-3定位于內體/溶酶體。所以我們接著探索CLM-3是否能夠直接和TLR9、MyD88或TRAF6相互作用。在進行免疫共沉淀實驗中，我們發(fā)現(xiàn)來自于CLM-3轉基因小鼠的原代腹腔巨噬細胞中的CLM-3能夠和TLR9發(fā)生微弱的相互結合，但是和MyD88或TRAF6則沒有相互結合。進一步的實驗表明，在CpG-ODN刺激后CLM-3和TLR9之間的結合增強。這些結果提示我們在CpG-ODN刺激的作用下，CLM-3能夠和TLR9的結合增強，進而通過促進TRAF6的泛素化來增強TRAF6的活性，最終強化了下游的信號通路，使更多的炎癥因子得到表達。 通過以上三部分的研究，增進了我們對于天然免疫應答過程的了解，通過研究我們發(fā)現(xiàn)在人外周血單核細胞來源的樹突狀細胞中DNMT1能夠與eIF3A、eIF3H以及CARP1相互結合，至于其潛在的作用還有待于進一步的研究。在小鼠腹腔巨噬細胞中觀察到的DNMT1能夠促進VSV和SeV引起的IFN-beta產(chǎn)生，使得我們明白DNMT1除了發(fā)揮其經(jīng)典的DNA甲基化轉移酶作用外，還有可能參與了天然免疫應答。通過研究CLM-3在小鼠巨噬細胞中對于Toll樣受體的功能，發(fā)現(xiàn)了CLM-3通過促進TRAF6的泛素化增強巨噬細胞中CpG-ODN引起的TLR9免疫應答及機制，以及CLM-3能夠在CpG-ODN的巨噬細胞中和TLR9的結合增強。同時發(fā)現(xiàn)CLM-3能夠增強MAPKs的磷酸化以及NF-κB的活化。上述研究拓寬了我們對于DNMT1和CLM-3分子的性質與功能的認識，豐富了TLR免疫識別及其調控機制的研究內容，也有望為感染免疫和腫瘤的研究與治療方法的尋找提供新的啟示。
【學位單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

第二軍醫(yī)大學博士學位論文2 結果2.1 質譜檢測分析人外周血來源的樹突狀細胞中與 DNMT1 相互結合的蛋白基于 Data-base 的研究思路， 我們在實驗室對人外周血來源的樹突狀細進行了全基因組甲基化測序以及 RNA 組分析，分析結果顯示，與表觀相關的甲基化轉移酶中，DNMT1 在未成熟的樹突狀細胞中高表達。這就促使我們去探DNMT1 在未成熟的樹突狀細胞中具體發(fā)揮著怎么樣的作用。按照實驗方法培養(yǎng)人外周血來源的樹突狀細胞后，收集半懸浮的 DCs 后DNMT1 的抗體進行免疫共沉淀去尋找潛在的相互結合蛋白。我們采用了質譜銀染方法對免疫共沉淀進行了檢測（圖 1-1）。

對于 DNMT1 我們采用了兩種不同克隆來源的抗體，結果顯示，使用不同克隆的抗體得到一直的結果（圖1-2 A-B）。圖 1-2 在樹突狀細胞中 co-IP 檢測 DNMT1 與 eIF3A、eIF3H 及 CARP1 的相互作用。Figure 1-2 Co-IP detected the interaction between DNMT1 and eIF3A, eIF3H,CAPR1 in DCs.

DNMT1 和 CLM-3 在天然免疫應答中的功能及機制以往的報道證實，DNMT1 主要在細胞核內發(fā)揮 DNA 甲基化轉移酶的作用[41]而 eIF3A 和 eIF3H 則主要在胞漿中發(fā)揮蛋白翻譯起始復合體組裝的功能，那們推測，DNMT1 是否也存在于胞漿中，它們之間的結合發(fā)生在胞漿中。我們外周血來源的樹突狀細胞進行了核質分離，分別在胞漿胞核中進行 co-IP 檢實驗結果證實了我們的猜想。DNMT1 與 eIF3A、eIF3H 之間的相互作用確實在胞漿中，盡管胞核中也存在著 eIF3A，但是兩者之間則沒有結合。針對 C這個主要在胞核中發(fā)揮細胞周期調控的蛋白（胞漿中也有存在），co-IP 檢示 CARP1 和 DNMT1 之間的結合則主要發(fā)生在胞核中（圖 1-3）。

【共引文獻】

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本文編號：2820337