實驗?zāi)康?肽聚糖識別蛋白(PGRPs)是一組從昆蟲到哺乳動物高度保守的模式識別分子。它們能夠識別細菌和細菌獨特的細胞壁成分肽聚糖(PGN)。果蠅有13種PGRP基因，被轉(zhuǎn)錄成至少17種蛋白質(zhì)。蚊子有7種PGRP基因，被轉(zhuǎn)錄成至少9種蛋白質(zhì)。以這些基因產(chǎn)物的假定結(jié)構(gòu)為依據(jù)，昆蟲的PGRPs被分成兩大類：短鏈PGRPs(PGRP-S)，它是一些小的細胞外蛋白質(zhì)(19-20KDα)，和長鏈PGRPs(PGRP-L)，它有長的轉(zhuǎn)錄本，是細胞間的或跨膜蛋白質(zhì)。所有昆蟲和哺乳動物PGRPs的C端區(qū)域氨基酸序列高度保守。此區(qū)域氨基酸序列與噬菌體17溶菌酶的氨基酸序列相比，有大約18％氨基酸序列相同，大約33％氨基酸序列相似。噬菌體T7溶菌酶是一種N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，此酶水解PGN的N-乙酰胞壁酸與L-丙氨酸之間的酰胺鍵。噬菌體T7溶菌酶是一種含有Zn~(2+)的蛋白質(zhì)，Zn~(2+)是其酰胺酶活性所必需的。噬菌體T7溶菌酶有四種氨基酸序列是它與Zn~(2+)結(jié)合及其酰胺酶活性所必需的。至少還有另外3種氨基酸序列是T7酰胺酶活性所必需的。就目前所知的36種昆蟲和哺乳動物PGRPs中，其中，12種PGRPs有四個保守的Zn~(2+)-結(jié)合氨基酸序列，剩下的另三種氨基酸序列也可能保守，也可能被替代，因而被推測有酰胺酶活性。它們之中的一種，果蠅PGRP-SC1b，最近被證實是一種N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。四種哺乳動物的PGRPs，只有PGRP-L有所有上述保守的氨基酸序列。因此，它被假定為一種酰胺酶。本實驗是檢測人類肽聚糖識別蛋白(PGRPs)是否具有裂解肽聚糖(PGN)的活性。 實驗方法 一、制備PGRrs重組體和蛋白質(zhì) 目前所講述的人類PGRP一S，PGRP一L，PGRP一Ia，PGRP一Ip和鼠PGRP一S 克隆于PcDI可A3.1載體，在Cos一細胞中表達。通過PCR制備人類PGRP一L 的缺矢突變體。人類PGRP一L和鼠的PGRP一S的單個氨基酸點突變體是通 過clontech(Pal。Alt。，cA)的位點突變試劑盒制備。所有的重組體亞克隆 于C一端伴有VS和6XHis標記物的PcDNA3 .1載體上。通過限制性內(nèi)切酶 酶切進行分析，測序。重組體PG盯s蛋白質(zhì)是通過短暫轉(zhuǎn)染表達重組體 PGRPS的C()S一細胞的裂解物或裂解物和上清液通過使用His一Bind試劑盒 (Novagen，Madison，朋)的親和層析而獲得的。根據(jù)生產(chǎn)商的建議，結(jié)合 液，漂洗液，洗脫液均含有20 mM Tris(PH7.9)，0.SM NaCI，1%Tritonx- 100和分別含有smM，20 mM或300 mM咪哇。這些蛋白質(zhì)儲存于含有 10%甘油的洗脫液，保存在一O“C中。 二、檢測PGRPs重組體消化膚聚糖(PGN)的能力和酞胺酶活性 可溶性未交聯(lián)的膚聚糖(PGN)是在青霉素G存在的條件下，由生長的 金黃色葡萄球菌通過萬古霉素一親和層析獲得的。在膚聚糖(PGN)N一端的 連接膚鏈之間的甘氨酸橋上標記有生物素，它的水解反應(yīng)按目前描述的方 法進行檢測。溶葡萄球菌素對金黃色葡萄球菌的甘氨酸橋有特異性，能使 生物素從PGN上完全丟失。由此證實了生物素實際上是位于這種未交聯(lián) PGN的N一端甘氨酸的邊界。750ng標記有生物素的PGN與10一SOng PGRP一L，PGF田一I華，PGRP一Ip和PGRP一S及其它們的突變體，在37“C下，共 同孵育3天，與10一20Ong的溶菌酶(51腳a，St.腸uis，MO)一起孵育或與 溶葡萄球菌素(來源于金黃色葡萄球菌溶血菌素的親和層析)一起孵育作 為陽性對照。與胰酶(來源于Sigma公司的牛胰腺)或與緩沖液一起孵育作 為陰性對照。酶消化后的生物素~PGN通過SDS一PAGE，及I~obilon一P免 疫印跡。高分子量的生物素一PGN用鏈球菌抗生物素蛋白一過氧化物(streP- tavidin一pero石dase)和ECL增強的化學(xué)發(fā)光法來檢測。等組分的2討消化產(chǎn) 物用抗一VS抗體作為抗體，用Westem Blot來檢測每一種PGRPs蛋白質(zhì)的存 在。 三、免疫熒光 Cos7細胞或人類肝纖維母細胞[HepGZ/C3A(燈CC，CRL一10741)〕培 養(yǎng)于蓋玻片上。用連接于PcDNA3 .1載體上的人類PGRP一L進行短暫轉(zhuǎn) 染，免疫熒光染色，無eaZ十和MgZ+的D過beee�！�5 PBs洗細胞。用2%多聚 甲醛(不滲透細胞，用于細胞表面染色)，或用含0.1%Tritonx一100的2%多 聚甲醛(可滲透細胞，用于細胞內(nèi)染色)4oC固定30分鐘，PBs洗�？挂籚5 鼠單克隆(5林擴Inl，Invitrogen，Carlsbad，CA)染色，pBS洗，二抗羊一抗一鼠IgG 異硫氰酸熒光素抗體(Sigma)染色，在免疫熒光顯微鏡下觀察。陰性對照 組是用空載體轉(zhuǎn)染細胞，按上述方法進行染色�；蛴眠B在peDNA3.1載體 上的PG即一L轉(zhuǎn)染細胞，只用二抗羊一抗一鼠IgG異硫氰酸熒光素抗體(沒有 VS抗體)染色。兩種陰性對照組顯示相似的低的熒光背景。 序列分析:DNA測序和對比。 實驗結(jié)果 一、檢測PGRPs重組體消化膚聚糖(PGN)的能力和酞胺酶活性 1.結(jié)果顯示:只有PGRP一L具有裂解膚聚糖(PGN)活性，與溶菌酶和 溶葡萄菌素作用相似(陽性對照)。我們制備了缺失PG即I區(qū)域的突變體 (醉95一76)和單個氨基酸替代的點突變體。然而，PCRP一Ia，PGRP一Ip及 PG砂一S不具有此活性，與緩沖液或胰酶作用相似(陰性對照)。‘PGRP一L 裂解PGN的動力學(xué)效應(yīng)與溶葡萄菌素的裂解PGN動力學(xué)效應(yīng)相似，比溶 菌酶裂解PGN的動力學(xué)
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R341
【部分圖文】：

具有依賴znZ‘的裂解膚聚糖的活性。標記有生物素的膚或與人類PGRP一L、PGRP一a、PGRP一p、PGRp一S、胰酶或與，或與PG砂一L在lmMzn，十存在下孵育。一2小時(B)，或smMEDTA存在下孵育72小時(c)。高分子量的高分estemblots，用鏈霉抗生物素蛋白和加強化學(xué)發(fā)光法(E的消化產(chǎn)物也用抗v5抗體通過Westembfots來檢測標準物，左面是PGN和各種PGRPS的位置。在溶菌酶30KDa的帶。它是溶葡萄菌素，本身能結(jié)合抗鏈霉抗三次相似的實驗中獲得的。

NOPGRP一LCOntrol組體PGRP一L在細胞中的表達。短暫轉(zhuǎn)染pGRP一L的COS一細細胞中，PGRP一L蛋白質(zhì)在細胞表面表達(左上圖)。在滲透性在細胞內(nèi)表達(右上圖)。它們是使用抗一V5抗體免疫熒光法(下圖示轉(zhuǎn)染有空載體(無PGRP~L)的非滲透性細胞和滲透性細四個相似的實驗。30

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本文編號：2820218