目的: 皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的難點是修復(fù)細(xì)胞的快速增殖分化、生長因子的持續(xù)有序作用和細(xì)胞外基質(zhì)支架的構(gòu)建。依據(jù)現(xiàn)代分子生物學(xué)和組織工程學(xué)的研究進(jìn)展,首先在體外克隆及構(gòu)建帶信號肽的人表皮生長因子基因和人血管內(nèi)皮生長因子基因真核表達(dá)質(zhì)粒,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將人表皮生長因子基因?qū)朐x體成人角質(zhì)形成細(xì)胞,將血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子基因?qū)朐x體成人皮膚成纖維細(xì)胞,分別證實轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達(dá)和分泌hEGF和hVEGF的能力,以達(dá)到為皮膚創(chuàng)傷原位修復(fù)和人工皮膚構(gòu)建研究中修復(fù)細(xì)胞快速增殖、生長因子穩(wěn)定有序表達(dá)目的。 方法: 第一章:設(shè)計人表皮生長因子(hEGF)基因及其信號肽基因引物,采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)從正常胚胎腎組織總RNA中擴增出hEGF基因及其信號肽基因序列,克隆入pGEM-T載體,質(zhì)粒抽提后經(jīng)酶切鑒定和序列分析驗證,隨后兩序列片段經(jīng)T4連接酶連接后克隆入表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+),再次質(zhì)粒抽提后經(jīng)酶切鑒定和序列分析。 第二章:采用兩步酶消化法對取自成人腹部的全層皮膚組織進(jìn)行消化,從表皮層中獲取角質(zhì)形成細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)基Defined Keratinocyte-SFM(DKSFM)傳代培養(yǎng)。后以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/hEGF導(dǎo)入角質(zhì)形成細(xì)胞,培養(yǎng)48小時后取細(xì)胞作RT-PCR、上清分別進(jìn)行放射免疫測定和MTT實驗。 第三章:設(shè)計人血管內(nèi)皮生長因子(hVEGF121)基因引物,從正常胚胎肝組織總RNA中行RT-PCR擴增出hVEGF121基因序列,克隆入pGEM-T載體,質(zhì)粒抽提后酶切鑒定,后將序列片段重新克隆入表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+),再次質(zhì)粒抽提后酶切鑒定和序列分析。 第四章:采用兩步酶消化法從成人腹部皮膚真皮中獲取成纖維細(xì)胞,以含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。后以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA3.1(+)/hVEGF121導(dǎo)入成纖維細(xì)胞,轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)48小時后取細(xì)胞作RT-PCR,上清分別行ELISA檢測、MTT實驗和Mile’s實驗。 結(jié)果: 第一章:將RT-PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳分別獲得約90 bp和180 bp
【學(xué)位單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

體并酶消化鑒定 序列和 EGF 序列分別克隆到 pGEM-T 載體, 并進(jìn)行I 消化后產(chǎn)生 3 kb 和 90 bp 大小的泳帶（見圖中泳道 化后產(chǎn)生 3 kb 和 180 bp 大小的泳帶（見圖中泳道 3 1-2 RT-PCR 擴增獲得人 EGF 及 SP cDNA 序列電泳圖M．DNA Marker （DL2000）１．SP cDNA ２，EGF cDNA圖 1-3 T-SP，T-EGF 雙酶切電泳圖M1．DNA Marker（Φ174） M2．DNA Marker（DL2000）

大小分別為 2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100GEM-T 載體并酶消化鑒定到的 SP 序列和 EGF 序列分別克隆到 pGEM-T 載體, 并進(jìn)行酶和 EcoR I 消化后產(chǎn)生 3 kb 和 90 bp 大小的泳帶（見圖中泳道 1、ind Ⅲ消化后產(chǎn)生 3 kb 和 180 bp 大小的泳帶（見圖中泳道 3、圖 1-2 RT-PCR 擴增獲得人 EGF 及 SP cDNA 序列電泳圖M．DNA Marker （DL2000）１．SP cDNA ２，EGF cDNA

T-SP測序結(jié)果與已知序列進(jìn)行SEQMAN分析

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 沈丹蓓,夏隆慶;角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用的進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊;2000年02期

2 肖仕初 ,夏照帆,楊s

本文編號：2818955