本論文由4部分內(nèi)容組成。(1)大鼠短間隔連續(xù)部分肝切除中再生肝上調(diào)表達(dá)基因的克隆與分析；(2)短間隔連續(xù)部分肝切除cDNA文庫(kù)構(gòu)建；(3)短間隔連續(xù)部分肝切除中再生肝特異表達(dá)全長(zhǎng)cDNA的克��；(4)短間隔連續(xù)部分肝切除模型中肝再生的不同時(shí)相與細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白檢測(cè)。 肝臟是哺乳動(dòng)物體中唯一能再生的器官。1931年Higgins和Anderson建立的一次性大鼠大部分肝切除提供了研究肝再生的理想模型，這一模型已在研究哺乳動(dòng)物組織和器官重建、細(xì)胞增殖、分化與去分化、生理生化調(diào)控等方面得到了十分廣泛的應(yīng)用。但由于肝再生的復(fù)雜性使得人們對(duì)肝再生的分子機(jī)理迄今了解尚少，為了更好的分析肝再生的分子機(jī)理，徐存拴等首次以一次性肝切除后4h(細(xì)胞進(jìn)入去分化期)和36h(細(xì)胞分裂高峰)建立了短間隔連續(xù)部分肝切除模型(short interval successive partial hepatectomy,SISPH)，該模型以兩個(gè)肝再生的關(guān)鍵時(shí)點(diǎn)為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)研究肝再生的分子機(jī)理，已受到國(guó)內(nèi)外同行的廣泛關(guān)注和認(rèn)可。 本研究以徐存拴等建立的短間隔連續(xù)部分肝切除0-4-40-76-112h為實(shí)驗(yàn)?zāi)?描州大學(xué)2皿2年傅士早業(yè)論人 大民漚間而汪滇邢艾肝勺卜歷再生申上們現(xiàn)這基困的兄陸與功訛方析 型，應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)，cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)，Southern雜交和蛋白質(zhì)印 跡技術(shù)與方法，探討了正常對(duì)照和 SISPH實(shí)驗(yàn)材料中差異表達(dá)的ESTs，全長(zhǎng)基 因及SISPH各時(shí)相周期蛋白和凋亡蛋白的表達(dá)，為研究肝再生分子機(jī)理提供了 新的思路和依據(jù)。 材料與方法： 采用 SISPH模型，以假手術(shù)為對(duì)照，以 SISPH 112h為處理，用抑制性消減 雜交技術(shù)（SUppreSSIOll Sllbtf8CtiVe hybndiZati。fi，SSH）研究了 SISpH 模型中差異 表達(dá)的基因；以SISPH 112h為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用RT－PCR 限制性酶切消化，蛋 白酶消化，蛋白包裝等方法構(gòu)建了 SISPH 12h。DNA文庫(kù)；以 SSH文庫(kù)中的 ESTS 為探針，借助于Southern雜交技術(shù)克隆了全長(zhǎng)。DNA基因；以SISPH中的 0A葉0刁64 為實(shí)驗(yàn)材料，借助于hstern blot技術(shù)對(duì)各切除時(shí)點(diǎn)細(xì)胞周期蛋白 和凋亡蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。 結(jié)果： l、克隆了 9個(gè)同源性為 100％EST，44個(gè)同源性不等的 ESTs，其中一個(gè)與 Genbarik無(wú)任何同源性的全新EST，這些上調(diào)表達(dá)的ESTs序列中，主要包括以 下幾類： 門）與正性、負(fù)性急性反應(yīng)因子或蛋白有關(guān)的基因。如血清淀粉樣因子A、 轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白、a－酸性糖蛋白、纖維蛋白原等，推測(cè)這些基因 的上調(diào)表達(dá)與肝再生有密切關(guān)系； （2）與線粒體氧化磷酸化有關(guān)的基因。如大鼠錨蛋白結(jié)合蛋白、線粒體細(xì)胞 色素氧化酶亞單位1、11、Ill等的上調(diào)表達(dá)可能是由于SISPH造成肝 局部缺氧而使線粒體功能性代償增生，也表明肝再生過(guò)程對(duì)能量有更多 的需求；NADH：ubiqulnone的上調(diào)表達(dá)表明依賴于 NADH（蘋果酸＋ 谷氨酸）的能量供應(yīng)途徑在肝再生中的作用更大； （3）與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的基因。與小鼠線粒體核糖酶蛋白基因有95％同源性 EST的發(fā)現(xiàn)為滿足肝再生需要而大量合成iNA，另外核糖體蛋白LS 的表達(dá)水平在肝再生中也升高可能為了滿足細(xì)胞增殖對(duì)蛋白質(zhì)的要求； （4）與細(xì)胞分裂相關(guān)的基因。如微管結(jié)合蛋白合成上調(diào)，它不僅是信號(hào)傳導(dǎo) 中的一個(gè)靶物，而且是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的一個(gè)重要5！擎分子CdC－2激酶的。 2 鄧州大學(xué)2002卓俗士早業(yè)論文 大肌厄月隔工人功方肝切階肝再生申上們表這篡因的丑巨與功止分析 靶物：微管結(jié)合蛋白還參與細(xì)胞有絲分裂中細(xì)胞骨架的形成，在細(xì)胞增 殖中起關(guān)鍵作用： （5）與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因。如精氨酸酶，它可能參與NO信號(hào)通路，共同 調(diào)節(jié)肝再生的信號(hào)傳導(dǎo)； （6）其它基因。如 T－激肽原，F(xiàn)K506，GABA等。 2、從SISPH 112h CDNA文庫(kù)中克隆出了 9個(gè) CDNA全長(zhǎng)基因，它們?cè)诟卧偕?中的可能作用是： 門）LRI基因（GenBank accession No．AF479660）與大鼠甲狀腺素結(jié)合蛋白 基因有73．7％的同源性，肝組織中甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的上調(diào)表達(dá)意義有 二：（1）打破了肝再生刺激因子與抑制因子的平衡作用，使肝細(xì)胞去 分化增強(qiáng)；（2）影響酶的誘導(dǎo)與氧
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2002
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

3正向消減文庫(kù)的建立兩次雜交，兩次PCR擴(kuò)增之后，分別得到了對(duì)照大鼠和SISPH后112h的正向消減文庫(kù)，未經(jīng)消減的對(duì)照消減文庫(kù)(1一C)見(jiàn)圖4。可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)材料大鼠正向消減文庫(kù)的分子量介于50一75obP之間，符合構(gòu)建消減文庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)。圖4正向消減PCR產(chǎn)物分析1.抑制性消減PCR產(chǎn)物;2.非抑制性消減PCR產(chǎn)物;M.小X174舊ae川。Fig.4ForwardsubtraetedPCRProduetsanalysissubtraetedPCRProduets;2.UnsubtraetedpCRProduets.M:中X174/(digestedbyHae川).4cDNA正向消減文庫(kù)消減效率的鑒定消減文庫(kù)消減效率的鑒定是判斷文庫(kù)成功與否的關(guān)鍵步驟。分別以抑制性PCR產(chǎn)物和非抑制性PCR產(chǎn)物為模板，用持家基因G3PDHS’、3’為引物進(jìn)行擴(kuò)增，分別在18，23，28，33個(gè)循環(huán)時(shí)檢測(cè)產(chǎn)物

圖7LDPCR產(chǎn)物檢測(cè)1，3為標(biāo)準(zhǔn)分子量，2為L(zhǎng)DPCR產(chǎn)物eteetionofIong一distaneePCRPrl，3DNAmarker，Lane2LDPCRProd度和感染宿主菌，我們得到了2.’“p徹ml的二級(jí)庫(kù)，符合建庫(kù)要個(gè)蘭色斑，無(wú)色斑太多而無(wú)法0個(gè)，重組率為:(1250一6)/12

.1探針標(biāo)記效率檢測(cè)標(biāo)記效率的檢測(cè)所用的對(duì)照是持家基因G3PDH，如圖9中左邊1所示，2為所標(biāo)記的目的片段，圖中右邊所示，從效率檢測(cè)可以看出，所標(biāo)記的片段可以用于Southern雜交。熱鑫纂圖9探針標(biāo)記效率的檢測(cè)，2分別代表G3PDH和目標(biāo)片段的探針標(biāo)記結(jié)果Fig.9EffieiencydeteetionofProbe一labeledG3PDHZ，Targetedfragment3.2入噬菌體環(huán)化為質(zhì)粒31’C培養(yǎng)BM25.8時(shí)，可激活其體內(nèi)的cre重組酶活性，cre重組酶可酶切MCS兩翼的10xP位點(diǎn)，產(chǎn)?

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 徐存拴,李永輝,段瑞峰,盧愛(ài)靈,夏民,吉愛(ài)玲;短間隔連續(xù)部分肝切除對(duì)大鼠生存和肝組織結(jié)構(gòu)的影響[J];動(dòng)物學(xué)報(bào);2001年06期

2 封青川,盧愛(ài)靈,李庚午,徐存拴;連續(xù)4次(每次間隔36h)部分肝切除對(duì)大鼠肝ACP、AKP、HSC70/HSP68和PCNA的影響[J];動(dòng)物學(xué)報(bào);2001年S1期

3 段瑞峰,昌靜峰,張冬芬,夏民,徐存拴;短間隔連續(xù)部分肝切除(SISPH)對(duì)肝細(xì)胞核和核仁的影響[J];動(dòng)物學(xué)報(bào);2001年S1期

4 梁衛(wèi)紅,林俊堂,李玉昌,徐存拴;短間隔連續(xù)部分肝切除(SISPH)中ADAMs基因表達(dá)差異分析[J];動(dòng)物學(xué)報(bào);2001年S1期

5 李永輝,胡軼紅,郭建林,韓亞偉,徐存拴;影響SPH大鼠肝蛋白水解酶活性因素分析[J];動(dòng)物學(xué)報(bào);2001年S1期

6 胡軼紅,郭建林,徐存拴;離子交換層析初步分離大鼠肝蛋白水解酶、ADAMs、ACP、AKP和PCNA[J];動(dòng)物學(xué)報(bào);2001年S1期

7 徐存拴,李永輝,胡軼紅,韓亞偉,郭建林;大鼠肝蛋白水解酶在短間隔連續(xù)部分肝切除(SISPH)中的活性變化[J];動(dòng)物學(xué)報(bào);2001年S1期

8 夏民,段瑞峰,昌靜峰,張冬芬,徐存拴;短間隔連續(xù)部分肝切除(SISPH)中糖原、G-6-Pase和RNA變化分析[J];動(dòng)物學(xué)報(bào);2001年S1期

9 唐望先,杜荔菁,張文英,陳春蓮;大部分肝切除后肝再生中TNF

本文編號(hào)：2819643