本研究選擇在中國倉鼠卵巢(chinese hamster ovary，CHO)細(xì)胞中表達(dá)具有中和 活性的抗基孔肯亞(chikungunya，Chik)病毒的嵌合抗體，以圖為Chik病的治療提供被動(dòng) 免疫制劑。 為表達(dá)嵌合抗體，首先克隆具有中和活性的抗Chik病毒的鼠源單克隆抗體 (monoclonal antibody，McAb)VL和VH基因及人工gG1亞類的CH和CK基因，通過融合PCR 構(gòu)建了抗Chik病毒的完整人-鼠嵌合抗體基因。將人-鼠嵌合抗體基因克隆到表達(dá)載體 的多克隆位點(diǎn)(mutiple cloning site，MCS)，構(gòu)建了恒定區(qū)(constant region，C區(qū)) 為cDNA序列的表達(dá)質(zhì)粒。 將構(gòu)建的嵌合抗體表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO／dhfr-細(xì)胞，經(jīng)氨甲喋呤(methotrexate，MTX) 加壓篩選，獲得最高表達(dá)量為2μg／ml的細(xì)胞株。對(duì)此細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)并純化抗Chik病 毒的嵌合抗體。純化的嵌合抗體在非還原SDS-PAGE中表現(xiàn)為一條約150kD的帶，在還 原SDS-PAGE中表現(xiàn)為一條約50kD和一條約25kD的帶；Western印跡結(jié)果顯示，全分子 蛋白和重鏈(heavy chain，H鏈)分子均可與羊抗人IgG Fc發(fā)生特異性免疫反應(yīng)；全分 子蛋白和輕鏈(light chain，L鏈)分子均可與羊抗人Kappa發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。用 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(indirect immunofloresence assay，IFA)檢測顯示，純化的嵌合 抗體與Chik病毒抗原發(fā)生強(qiáng)反應(yīng)，說明表達(dá)的嵌合抗體保留了親本鼠源McAb的抗原結(jié) 合活性。用不同濃度的純化嵌合抗體和鼠源McAb進(jìn)行微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)，結(jié)果25μg／ml 的嵌合抗體和15μg／ml的鼠源McAb可以保護(hù)細(xì)胞不出現(xiàn)病變，說明嵌合抗體具有與鼠 源McAb相同的生物學(xué)活性。 為了提高嵌合抗體的表達(dá)量，我們嘗試用Flp-InTM系統(tǒng)表達(dá)嵌合抗體，獲得表達(dá)量為 1μg／ml的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。遺憾的是此系統(tǒng)不能進(jìn)行基因擴(kuò)增，基于此，我們構(gòu)建了在 染色體的轉(zhuǎn)錄活性位點(diǎn)整合了FRT序列的CHO／dhfr-細(xì)胞株，命名為CHO／dhfr-FRT+。在 此細(xì)胞株中，表達(dá)了抗chik病毒的嵌合抗體，通過MTX加壓篩選，獲得表達(dá)量為5μg／ml 的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，是Flp-InTM表達(dá)系統(tǒng)的5倍，是CHO／dhfr-表達(dá)系統(tǒng)的2． 5倍。 有報(bào)道稱，Ck基因組序列能改善抗體在CHO細(xì)胞中的表達(dá)。但未見CH基因組序列是 否較cDNA序列表達(dá)量高的報(bào)道。因此克隆人抗體分子IgG1亞類CH區(qū)基因組序列并構(gòu)建 了C區(qū)為基因組序列的雙基因表達(dá)質(zhì)粒，用F1p-InTM系統(tǒng)研究了C區(qū)為cDNA序列和基 因組序列對(duì)抗體表達(dá)量的差異，結(jié)果顯示CH區(qū)使用cDNA序列是基因組序列抗體表達(dá)量的 3倍。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

一IVL.和V

通過融合PCR方法擴(kuò)增嵌合抗體L、H鏈基因(見圖1一4)，并將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD一T載體上(見圖1一5)進(jìn)行DNA序列測定，結(jié)果見圖1一6。工gGI是由L鏈和H鏈組成的異源二聚體分子，含有4對(duì)鏈間二硫鍵和犯對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵，見圖1一7。我們得到的完整嵌合抗體L、H鏈基因氨基酸序列分別含有5個(gè)和n個(gè)半膚氨酸，與預(yù)期結(jié)果完全一致。12312叢二_2000—匕00250—100bP15000100007500500025001000250圖1一4嵌合抗體L?

humanlgG:4:MouseMeAbagainstChikVlrLIS圖3一4純化的嵌合抗體的Western印跡分析Fig3一4W七sternblotanalysisofthePurifiedehimerieantibody1and4:MouseMeAb;2ands:StandardhumanIgG:3and6:Purifiedehimerieantibody:4:Proteinm毗e:(人斤xlo3)2.5純化的嵌合抗體的SDS一以GE和Western印跡取2陀純化的嵌合抗體進(jìn)行SDS一PAGE和Western印跡檢測，結(jié)果見圖3一3和圖3一4。在非還原SDS一PAGE電泳中，顯示一條約150kD的蛋白條帶(未顯示圖片);在還原SDS一PAGE電泳中，顯示2條帶，經(jīng)過TOTALLAB軟件分析相對(duì)分子質(zhì)量分別為52kD和24kD，分別與H鏈和L鏈的預(yù)期大小一致，見圖3一5。用H即標(biāo)記的羊抗人工gGF。進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示與全分子抗體和H鏈均可發(fā)生反應(yīng)

【共引文獻(xiàn)】

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6 畢玉平,廖俊杰,單雷,王興軍,徐平麗;番茄雙抗TMV和CMV基因工程的研究[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);1997年06期

7 單雷,畢玉平,王興軍,徐平麗,李廣存;雙抗TMV和CMV轉(zhuǎn)基因番茄后代的遺傳分析[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);1998年04期

8 葛宏華,孫莉?qū)?張其瑞;家蠶血淋巴蛋白的發(fā)育變化和BmLSP的純化[J];安徽大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2001年03期

9 王北艷;曹寧;湯暉;;苜蓿中華根瘤菌電轉(zhuǎn)條件的優(yōu)化[J];安徽農(nóng)學(xué)通報(bào);2008年11期

10 劉可杰,呂淑霞,沈世華;FaDREB1基因RNAi的植物表達(dá)載體的構(gòu)建[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2005年07期

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8 馬s

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