研究背景 當(dāng)前人口的快速增長(zhǎng)是一個(gè)亟待解決的全球問題,據(jù)統(tǒng)計(jì),截止至2050年,世界人口將超過10億人次,因此尋找一種安全、有效、廉價(jià)、易接受的避孕方法對(duì)于全世界特別是發(fā)展中國(guó)家是十分迫切的。免疫避孕由于具有諸多優(yōu)點(diǎn),目前已成為男性避孕藥具中具有廣闊發(fā)展前景的研究方向之一。富含半胱氨酸分泌蛋白-1(Cysteine-rich secretory protein-1, CRISP-1)是一種由附睪頭部上皮細(xì)胞合成分泌的雄激素依賴型糖蛋白,通過與卵子表面的互補(bǔ)位點(diǎn)相作用,參與精卵融合的一系列過程。研究表明重組CRISP-1蛋白和純化的天然CRISP-1蛋白在多個(gè)動(dòng)物模型中均可以引起特異性免疫應(yīng)答反應(yīng),所產(chǎn)生的特異性抗體可通過調(diào)控精子的獲能及影響精卵融合,從而影響生育效果,提示CRISP-1是一種具有廣闊發(fā)展前景的避孕候選疫苗。除了傳統(tǒng)的減毒、滅活疫苗及蛋白質(zhì)亞單位疫苗外,另一種在體內(nèi)針對(duì)精子蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法,是直接將編碼精子蛋白的質(zhì)粒DNA注射至宿主體內(nèi),即DNA疫苗,但由于裸DNA帶負(fù)電荷,難以通過脂質(zhì)的細(xì)胞膜；在體內(nèi)易被核酸酶降解而迅速清除,DNA疫苗免疫效果多不盡理想。殼聚糖是一種帶正電荷的天然聚合物,無細(xì)胞毒性,且具有很好的生物相容性和生物降解性,近年來作為一種新的載體系統(tǒng)已經(jīng)被成功的應(yīng)用于基因的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染,并有研究證實(shí),殼聚糖與不同抗原一起給藥時(shí)可起到協(xié)同作用,優(yōu)化免疫效果。本研究以小鼠Crisp-1cDNA為靶基因,應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建鼠真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Crisp-1,然后采用復(fù)凝法制備殼聚糖-pcDNA3.1-Crisp-1(CS/DNA)納米復(fù)合物,對(duì)其相關(guān)物理學(xué)、生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定,并與裸質(zhì)粒DNA疫苗,重組mCrisp-1蛋白疫苗比較其免疫避孕效應(yīng)及安全性,為開發(fā)新型男性避孕疫苗奠定基礎(chǔ)。 研究目的 1.構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Crisp-1; 2.構(gòu)建載Crisp-1DNA疫苗的殼聚糖納米粒； 3.評(píng)估真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Crisp-1的免疫避孕效應(yīng)及殼聚糖納米粒作為DNA避孕疫苗載體的有效性和安全性。 研究方法 1.采用基因重組的方法構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Crisp-1,行BamHI和HindⅢ雙酶切鑒定和序列比對(duì)驗(yàn)證。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Crisp-1或空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞,48h后行RT-PCR和間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)COS-7細(xì)胞中mCrisp-1mRNA和蛋白水平的表達(dá)。 2.復(fù)凝法制備質(zhì)粒濃度分別為50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的殼聚糖-pcDNA3.1-Crisp-1納米粒(CS/DNANPs),紫外分光光度儀檢測(cè)不同質(zhì)粒濃度下DNA的包埋率。于透射電子顯微鏡(TEM)下觀察納米粒形態(tài),用納米粒度分析儀測(cè)定納米粒的平均粒徑、多分散度和zeta電位。1%瓊脂糖凝膠電泳分析殼聚糖納米粒與質(zhì)粒的結(jié)合力及在核酸酶條件下殼聚糖納米粒對(duì)質(zhì)粒DNA的保護(hù)作用。然后將載Crisp-1DNA疫苗的殼聚糖納米粒直接轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞,與脂質(zhì)體比較其細(xì)胞毒性,并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)(?)口間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法鑒定轉(zhuǎn)染后mCrisp-1在COS-7細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。 3.將雌、雄性BALB/c小鼠分別隨機(jī)分為5組：生理鹽水組、pcDNA3.1空載體組、裸質(zhì)粒pcDNA3.1-Crisp-1DNA疫苗組、CS/DNA納米粒組和重組(?)nCRISP-1蛋白組。每只動(dòng)物初次免疫及加強(qiáng)免疫總共免疫3次(分別記為0周、2周和4周),經(jīng)股四頭肌注射,每次接種DNA或重組mCRISP-1蛋白劑量為50μg。分別于每次免疫前一天及第一次免疫后2、4、6、8、10、12周行內(nèi)眥靜脈取血,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中Crisp-1抗體水平,(?)(?)estern blot和中和性試驗(yàn)檢測(cè)小鼠血清中Crisp-1抗體的特異性。第三次免疫后2周,將各組雌、雄性小鼠分別與生育力正常的異性小鼠進(jìn)行合籠,次日凌晨見陰栓視為交配成功,將雌鼠單獨(dú)喂養(yǎng),3周后觀察各組小鼠的妊娠率和每窩產(chǎn)仔數(shù)。給藥期間,密切觀察小鼠有無過敏反應(yīng),局部炎性反應(yīng)及中毒現(xiàn)象,在末次給藥后8周,取各組小鼠重要臟器和生殖器官行病理學(xué)檢查。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Crisp-1經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后,行1%瓊脂糖凝膠電泳,得到1條約5.4kb的pcDNA3.1片段和約750bp的mCrisp-1片段,測(cè)序結(jié)果與mCrisp-1基因序列一致。轉(zhuǎn)染后COS-7細(xì)胞RT-PCR結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Crisp-1轉(zhuǎn)染組擴(kuò)增出一條約750bp的特異性條帶,而空載體組和空白對(duì)照組無特異性條帶出現(xiàn)。間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示重組pcDNA3.1-Crisp-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞可見強(qiáng)烈的FITC標(biāo)記的綠色熒光,空載體組和空白對(duì)照組未見綠色熒光。 2.采用紫外分光光度儀檢測(cè)殼聚糖納米粒對(duì)不同濃度質(zhì)粒DNA的包埋率,結(jié)果顯示,三種濃度下質(zhì)粒包埋率均達(dá)90%以上,但當(dāng)質(zhì)粒濃度為100μg/mL時(shí),殼聚糖對(duì)質(zhì)粒DNA的包埋率最高(94.09±0.17%),且與另兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)CS/DNA納米復(fù)合物形態(tài)較為規(guī)則,近球形,大小較均一,直徑多在150-200nm之間,散在分布,分散性好。納米粒度分析儀測(cè)定結(jié)果顯示,納米粒平均直徑為189.3nm,多分散指數(shù)為0.459,粒徑分布范圍較窄。Zeta電位約為+0.2mV。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,殼聚糖與DNA疫苗結(jié)合后使質(zhì)粒DNA完全阻滯于加樣孔中,并可保護(hù)質(zhì)粒DNA不受核酸酶降解。MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示CS/DNA納米復(fù)合物組細(xì)胞存活率與裸質(zhì)粒組相比無明顯差異(p0.05),但顯著高于脂質(zhì)體組(p0.01)。將未處理的正常COS-7細(xì)胞和經(jīng)不同方式轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Crisp-1的COS-7細(xì)胞分別行間接免疫熒光檢測(cè),結(jié)果顯示,無論是用脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞還是CS/DNA納米復(fù)合物直接轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中均可看到明亮的綠色熒光,而未處理組和pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞未見綠色熒光,表明殼聚糖可有效的介導(dǎo)Crisp-1DNA疫苗在真核細(xì)胞中表達(dá)。qRT-PCR檢測(cè)經(jīng)不同方法轉(zhuǎn)染后COS-7細(xì)胞中Crisp-1mRNA的表達(dá)水平,結(jié)果分析顯示,空白對(duì)照組和pcDNA3.1空載體組未檢測(cè)到Crisp-1mRNA表達(dá),脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM組Crisp-1mRNA表達(dá)水平略高于CS/DNA納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 ELISA結(jié)果顯示,無論是雌性還是雄性小鼠,生理鹽水和pcDNA3.1(+)空載體均未誘導(dǎo)特異性Crisp-1抗體產(chǎn)生,而pcDNA3.1-Crisp-1免疫組小鼠均在初次免疫后2周即產(chǎn)生特異性抗體,抗體滴度顯著高于空載體組和生理鹽水組(p0.05),并于末次免疫后4周達(dá)到最高峰,停止免疫后8周抗體滴度又逐漸下降。CS/DNA納米復(fù)合物和重組mCRISP-1蛋白免疫小鼠血清抗體滴度顯著高于裸質(zhì)粒pcDNA3.1-Crisp-1免疫小鼠(p0.05),但CS/DNA納米復(fù)合物免疫組小鼠和重組mCRISP-1蛋白免疫組小鼠血清抗體滴度相比較,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。用Western blot法檢測(cè)免疫后小鼠血清中Crisp-1抗體的特異性,結(jié)果顯示,pcDNA3.1-Crisp-1、CS/DNA NPs和重組mCRISP-1蛋白免疫后的血清可與純化的重組mCRISP-1蛋白反應(yīng),產(chǎn)生一條約36kDa的弱帶和一條約32kDa的強(qiáng)帶,并與天然的精子粗提蛋白反應(yīng)后可形成一條約30kDa的特異性條帶。而生理鹽水、空載體pcDNA3.1免疫組及免疫前血清與重組mCRISP-1和天然精子粗提蛋白反應(yīng)后均未見特異性條帶產(chǎn)生。中和試驗(yàn)結(jié)果顯示各組免疫后血清與重組mCRISP-1蛋白共同孵育,不能與重組(?)nCRISP-1蛋白和天然精子蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)。生育試驗(yàn)結(jié)果顯示雌性小鼠各組妊娠率和平均每窩產(chǎn)仔數(shù)分別為：生理鹽水組(100%,10.754±0.55),pcDNA3.1空載體組(90.9%,10.69±0.44), pcDNA3.1-Crisp-1組(45.5%,6.80±0.58), CS/DNA納米復(fù)合物組(25%,4.00±0.57),重組mCRISP-1蛋白組(25%,4.33±0.33)；雄性小鼠各組妊娠率和平均每窩產(chǎn)仔數(shù)分別為：生理鹽水組(100%,10.57±0.56),pcDNA3.1空載體組(100%,10.43±0.55),pcDNA3.1-Crisp-1組(40%,6.17±0.31),CS/DNA納米復(fù)合物組(26.7%,3.75±0.48),重組mCRISP-1蛋白組(26.7%,3.75±0.25)。與生理鹽水組相比,pcDNA3.1空載體組雌雄性小鼠妊娠率及平均每窩產(chǎn)仔數(shù)無明顯差別(p0.05),但其他三組雌雄性小鼠妊娠率及平均每窩產(chǎn)仔數(shù)均呈不同程度降低。盡管pcDNA3.1-mCRISP-1免疫組雌雄性小鼠生育率和平均每窩產(chǎn)仔數(shù)均顯著低于生理鹽水組(p0.05)和pcDNA3.1免疫組(p0.05),但顯著高于CS/DNA納米復(fù)合物組和重組mCRISP-1蛋白免疫組(p0.05,p0.05)。雌雄性CS/DNA納米復(fù)合物和重組mCRISP-1蛋白免疫組小鼠生育率和平均每窩產(chǎn)仔數(shù)均無顯著性差異(p0.05)。雌雄性小鼠之間生育抑制率差異也無顯著性意義(p0.05)。給藥期間,各組小鼠均未見明顯異常。與對(duì)照組相比,免疫后各組小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等重要臟器及生殖器官均未見明顯病理性改變。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Crisp-1及殼聚糖-pcDNA3.1-Crisp-1納米復(fù)合物。pcDNA3.1-Crisp-1DNA疫苗具有一定的生育抑制效果,但避孕效果不盡理想。殼聚糖納米粒可顯著提高pcDNA3.1-Crisp-1DNA疫苗的免疫效應(yīng),并具有良好的安全性。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R392.6
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本文編號(hào)：
2814709
