目的：從弓形蟲昆山分離株和RH株總DNA中克隆GRA6基因片段， 構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-GRA6，與本實驗室已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒 pGEX-SAG1分別導(dǎo)入大腸桿菌中表達，且對表達產(chǎn)物進行純化，以 純化的該兩種重組蛋白作為診斷抗原，構(gòu)建新型弓形蟲基因工程診斷 試劑盒，用于檢測弓形蟲感染及鑒別急、慢性期弓形蟲病。 方法：1．用CF-11纖維素柱快速提純弓形蟲速殖子，抽提弓形蟲總 DNA；根據(jù)基因庫已報告的基因序列，設(shè)計并合成擴增GRA6基因 的一對引物，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從昆山分離株和RH株總 DNA中分別擴增編碼GRA6的基因片段，導(dǎo)入質(zhì)粒pBluescriptIIS(-)， 經(jīng)DNA測序分析后，從構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pSK-GRA6中以BamHI 和EcoRI雙酶切出GRA6基因片段，以相同的酶切位點導(dǎo)入表達質(zhì) 粒pGEX-5X-3，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-GRA6。將重組質(zhì)粒pGEX-GRA6 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-Codon Plus(DE3)-RP菌株中，在IPTG誘導(dǎo)下表 達，超聲破壁后，SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物的表達形式，對上清液中 表達產(chǎn)物經(jīng)硫酸銨沉淀、Sephadex G50脫鹽和GST親和層析柱進行 目的蛋白的純化。通過Western blotting檢測其純化重組抗原的免疫 反應(yīng)性。用獲得的純化GST-GRA6重組蛋白作為包被抗原，建立間 接法ELISA檢測弓形蟲感染者血清特異性GRA6-IgM和GRA6-IgG 的診斷方法；用獲得的純化GST-GRA6重組蛋白作為包被抗原，建 立膠體金斑點滲濾法(DIGFA)檢測弓形蟲感染者血清特異性IgM 弓形蟲GRA6和SAG!幕l州克降表達及其產(chǎn)物的應(yīng)用 中文摘要 和工gG的方法。2.將重組質(zhì)粒pGEX一SAGI轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21一Codon Plus(DE3)一RP菌株中，在IPTG誘導(dǎo)下表達;超聲破壁后，sDs一隊GE 分析表達產(chǎn)物的表達形式。通過改變培養(yǎng)溫度和LB培養(yǎng)液pH，誘 導(dǎo)重組蛋白在上清液中表達，并對上清液中表達產(chǎn)物經(jīng)硫酸按沉淀、 SephadexG一50脫鹽、GST親和層析柱和sephadexG一1 50凝膠過濾柱 進行目的蛋白純化。通過Westem blotting檢測其純化重組蛋白的免 疫反應(yīng)性。用獲得的純化GST一SAGI重組蛋白作為包被抗原，建立 間接ELIsA法檢測人血清中弓形蟲特異性IgM和IgG抗體的診斷方 法。 結(jié)果1.在我們所比較GRA6 336個堿基中，弓形蟲昆山分離株與RH 株之間堿基基本一致;得到一分子量為49kDa的重組蛋白，通過 westem blotting證實該重組蛋白能被弓形蟲感染者血清特異性IgM 和IgG所識別。GRA6以融合蛋白(GST一GRA6)的形式在大腸桿菌中 得到了高效表達。對表達產(chǎn)物畝溶性分析表明，表達蛋白在上清液中 和包涵體中均有表達。在上清中表達的可溶性蛋白經(jīng)純化后蛋白純度 可達90%以上。用純化的GRA6重組蛋白構(gòu)建的ELISA診斷試劑盒 和DIGFA診斷試劑盒對弓形蟲感染者血清進行檢測，其結(jié)果一致。 2.在常溫條件下(37‘C)，SAGI以融合蛋白(GST一SAGI)的形式在大 腸桿菌中得到了高效表達，對表達產(chǎn)物可溶性分析表明，表達蛋白以 包涵體形式存在。在低溫和升高LB培養(yǎng)液pH條件下，在上清液中 得到了可溶性重組蛋白，經(jīng)純化后蛋白純度可達90%以上。Westem 弓形蟲川之八6和S八(月呆}川克降表達及比產(chǎn)物的應(yīng)用甲丈、芍吐 b!otting分析表明一該純化蛋白能被弓形蟲感染者一血一清所識別。川純化 的SAG!重組蛋白構(gòu)建的ELISA診斷試劑盒對弓形蟲感染者血一清進 行sAGI一lgM一ELISA檢測，結(jié)果顯示:該診斷試劑盒只對部分弓形 蟲多克隆IgM抗體血清呈陽性結(jié)果，選用其中一份陽性和一份陰性 血清進行免疫印跡試驗，其結(jié)果與我們用SAGI一IgM一ELISA檢測結(jié) 果相同，表明我們研制的檢測SAGI一工gM一ELISA診斷試劑盒司一用于 急、慢性期弓形蟲感染的鑒別。 結(jié)論1.①弓形蟲昆!_助分離株和RH株GRA6基因片段少匕乎完全一 致;②在大腸桿菌中得到了高效表達的可溶性重組蛋白GST一GRA6; ③該重組蛋白能被弓形蟲感染者血清特異性IgM和工gG所識別，可 用于構(gòu)建具有高度敏感性和特異性的弓形蟲感染檢測試劑盒。用純化 的GRA6重組蛋白構(gòu)建的ELISA診斷試劑盒和DIGFA診斷試劑盒對 弓形蟲感染者血清進行檢測，其結(jié)果一致。 2.①在大腸桿菌中表達了GST一SAGI重組蛋白;②通過改變培養(yǎng)溫度 和LB培養(yǎng)液pH，首次成功地在上清液中得到了可溶性SAGI重組 蛋白;③該可溶性重組蛋白能被急性期弓形蟲感染者血清IgM所識別， 可用于構(gòu)建弓形蟲檢測試劑盒，鑒別急、慢性期弓形蟲感染。
【學位單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2003
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

400p1buffe:A(1SOmMNaCI25mMDs和蛋白酶K(proteinaseK)，處理Zhr，冷卻至室溫后加等體積水乙醇和0.3倍體積的3M乙酸，以12，000r/min離心3Omin，去上in，后12，000r/minIOmin，去上清，存放一70℃冰箱。結(jié)果提純弓形蟲結(jié)果:蟲體回收率為25胞清除率<10%;收集液離心鏡檢

A的1%瓊脂糖電泳結(jié)果，昆山株geleleetroPhorsisforidentifinedwithE.BLane2.kunshanstrain討論法較多，各有優(yōu)缺點[35]。釋放，提高蟲體回收率，原。但所需時間長，工作力有較大差別，處理時間，，

1.GRA6基因的PCR擴增和重組質(zhì)粒的構(gòu)建用我們設(shè)計的引物分別從弓形蟲昆山分離株與R士1株總DNA上擴增GRA6基因片段，均得到一長度為336bP的基因片段(圖1)。

【引證文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 何光志;田維毅;王平;王文佳;奚錦;俞琦;黃高;王乾宇;;抗弓形蟲噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建及篩選[J];湖北大學學報(自然科學版);2011年03期

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 王妍;弓形蟲GRA3基因的原核表達及單克隆抗體的制備與初步應(yīng)用研究[D];延邊大學;2012年

本文編號：2814101