研究表明，人體內(nèi)天然存在的抗角蛋白自身抗體(anti-keratin auto antibody，AK auto Ab)是維持機(jī)體免疫狀態(tài)平衡的重要成員。一些病理情況下(如銀屑病、接觸性皮炎等)，AK auto Ab的存在有利于限制病情的進(jìn)展，促進(jìn)損傷的修復(fù)，對(duì)機(jī)體具有有益的保護(hù)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外研究都提示當(dāng)機(jī)體內(nèi)AK auto Ab水平低下時(shí)人為補(bǔ)充抗角蛋白抗體有可能成為該類疾病新的治療措施。為此我們嘗試采取基因工程的方法，利用噬菌體抗體庫等技術(shù)制備具有高特異性和高親和力的人源性抗角蛋白抗體。 半合成噬菌體抗體庫庫容4.0×10~8，經(jīng)擴(kuò)增后滴度為1×10~(14)cfu／ml。以人表皮角蛋白為抗原對(duì)其進(jìn)行4輪“親和吸附—洗脫—擴(kuò)增”篩選，挑取單集落培養(yǎng)表達(dá)噬菌體抗體并鑒定其與角蛋白結(jié)合的活性和特異性；初步獲得的陽性克隆經(jīng)可變區(qū)基因指紋分析確定其基因種類的異同，選擇不同的克隆以內(nèi)切酶去除載體上的基因Ⅲ，表達(dá)可溶性Fab段，進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。親和力成熟采用鏈替換技術(shù)，分離未經(jīng)免疫的正常人淋巴細(xì)胞提取RNA，RT-PCR擴(kuò)增K輕鏈基因和IgG／IgM重鏈Fd段基因分別構(gòu)建輕鏈庫和重鏈庫。先以篩選所獲克隆的重鏈與輕鏈庫隨機(jī)搭配進(jìn)行輕鏈替換，對(duì)形成的換鏈庫采用解離速率篩選法(off-rate selection)選取親和力提高的克�。蝗缓笤賹@得的輕鏈基因與重鏈庫基因重組進(jìn)行重鏈替換，篩選親和力進(jìn)一步提高的克隆，并進(jìn)行抗體抗原結(jié)合活性及特異性檢測(cè)、親和力測(cè)定和可變區(qū)基因序列比較分析。 通過篩選獲得了4個(gè)能與角蛋白特異結(jié)合的噬菌體抗體克
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2000
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

18個(gè)特異陽性的克隆經(jīng)PCR擴(kuò)增，其中17個(gè)均擴(kuò)增出K鏈和重鏈Fd段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)CL一6B分子篩純化后以Hinfl酶切得到4種不同的酶切圖形，見圖4。說明17個(gè)陽性菌落系來自4個(gè)不

Fig4Hinff6ngerPrintingoftheVgenesofthePositvieelones將4種陽性克隆的質(zhì)粒以N’heI酶切，電泳顯示均有6obop士的基因m條帶放出，見圖5。酶切液連接后電轉(zhuǎn)化.EocliXLI一Blue，挑取單集落培養(yǎng)提質(zhì)粒用Smal+Sacl酶切證明基因m已被切除見圖6(帶有基因m者放出約.27kb和2.Ikb條帶，無基因m者放出約2.7kb和1.4kb條帶，酶切位點(diǎn)見圖1)。各克隆菌液用PITG誘導(dǎo)表達(dá)可溶性Fba段，EUSA檢測(cè)顯示4種克隆均表達(dá)出了人Fba。以不同濃度人gIG的EuSA讀數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各克隆表達(dá)Fba段的相對(duì)含量大約在100n創(chuàng)ml~1000n留ml左右，見表5;再以ELISA檢測(cè)Fba的抗原結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)僅克隆1表達(dá)出了能與角蛋白抗原特異性結(jié)合的Fba抗體

的基因m條帶放出，見圖5。酶切液連接后電轉(zhuǎn)化.EocliXLI一Blue，挑取單集落培養(yǎng)提質(zhì)粒用Smal+Sacl酶切證明基因m已被切除見圖6(帶有基因m者放出約.27kb和2.Ikb條帶，無基因m者放出約2.7kb和1.4kb條帶，酶切位點(diǎn)見圖1)。各克隆菌液用PITG誘導(dǎo)表達(dá)可溶性Fba段，EUSA檢測(cè)顯示4種克隆均表達(dá)出了人Fba。以不同濃度人gIG的EuSA讀數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各克隆表達(dá)Fba段的相對(duì)含量大約在100n創(chuàng)ml~1000n留ml左右，見表5;再以ELISA檢測(cè)Fba的抗原結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)僅克隆1表達(dá)出了能與角蛋白抗原特異性結(jié)合的Fba抗體，另3個(gè)克隆所表達(dá)的Fab不能與角蛋白抗原結(jié)合見表6。表中的陽性對(duì)照為從人外周血提取的多克隆抗角蛋白抗體(gIG一AKuatoAb)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號(hào)：2814054