研究表明，人體內(nèi)天然存在的抗角蛋白自身抗體(anti-keratin auto antibody，AK auto Ab)是維持機體免疫狀態(tài)平衡的重要成員。一些病理情況下(如銀屑病、接觸性皮炎等)，AK auto Ab的存在有利于限制病情的進展，促進損傷的修復(fù)，對機體具有有益的保護作用。動物實驗和體外研究都提示當機體內(nèi)AK auto Ab水平低下時人為補充抗角蛋白抗體有可能成為該類疾病新的治療措施。為此我們嘗試采取基因工程的方法，利用噬菌體抗體庫等技術(shù)制備具有高特異性和高親和力的人源性抗角蛋白抗體。 半合成噬菌體抗體庫庫容4.0×10~8，經(jīng)擴增后滴度為1×10~(14)cfu／ml。以人表皮角蛋白為抗原對其進行4輪“親和吸附—洗脫—擴增”篩選，挑取單集落培養(yǎng)表達噬菌體抗體并鑒定其與角蛋白結(jié)合的活性和特異性；初步獲得的陽性克隆經(jīng)可變區(qū)基因指紋分析確定其基因種類的異同，選擇不同的克隆以內(nèi)切酶去除載體上的基因Ⅲ，表達可溶性Fab段，進行進一步鑒定。親和力成熟采用鏈替換技術(shù)，分離未經(jīng)免疫的正常人淋巴細胞提取RNA，RT-PCR擴增K輕鏈基因和IgG／IgM重鏈Fd段基因分別構(gòu)建輕鏈庫和重鏈庫。先以篩選所獲克隆的重鏈與輕鏈庫隨機搭配進行輕鏈替換，對形成的換鏈庫采用解離速率篩選法(off-rate selection)選取親和力提高的克隆；然后再將獲得的輕鏈基因與重鏈庫基因重組進行重鏈替換，篩選親和力進一步提高的克隆，并進行抗體抗原結(jié)合活性及特異性檢測、親和力測定和可變區(qū)基因序列比較分析。 通過篩選獲得了4個能與角蛋白特異結(jié)合的噬菌體抗體克
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2000
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

18個特異陽性的克隆經(jīng)PCR擴增，其中17個均擴增出K鏈和重鏈Fd段。擴增產(chǎn)物經(jīng)CL一6B分子篩純化后以Hinfl酶切得到4種不同的酶切圖形，見圖4。說明17個陽性菌落系來自4個不

Fig4Hinff6ngerPrintingoftheVgenesofthePositvieelones將4種陽性克隆的質(zhì)粒以N’heI酶切，電泳顯示均有6obop士的基因m條帶放出，見圖5。酶切液連接后電轉(zhuǎn)化.EocliXLI一Blue，挑取單集落培養(yǎng)提質(zhì)粒用Smal+Sacl酶切證明基因m已被切除見圖6(帶有基因m者放出約.27kb和2.Ikb條帶，無基因m者放出約2.7kb和1.4kb條帶，酶切位點見圖1)。各克隆菌液用PITG誘導(dǎo)表達可溶性Fba段，EUSA檢測顯示4種克隆均表達出了人Fba。以不同濃度人gIG的EuSA讀數(shù)繪制標準曲線，計算各克隆表達Fba段的相對含量大約在100n創(chuàng)ml~1000n留ml左右，見表5;再以ELISA檢測Fba的抗原結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)僅克隆1表達出了能與角蛋白抗原特異性結(jié)合的Fba抗體

的基因m條帶放出，見圖5。酶切液連接后電轉(zhuǎn)化.EocliXLI一Blue，挑取單集落培養(yǎng)提質(zhì)粒用Smal+Sacl酶切證明基因m已被切除見圖6(帶有基因m者放出約.27kb和2.Ikb條帶，無基因m者放出約2.7kb和1.4kb條帶，酶切位點見圖1)。各克隆菌液用PITG誘導(dǎo)表達可溶性Fba段，EUSA檢測顯示4種克隆均表達出了人Fba。以不同濃度人gIG的EuSA讀數(shù)繪制標準曲線，計算各克隆表達Fba段的相對含量大約在100n創(chuàng)ml~1000n留ml左右，見表5;再以ELISA檢測Fba的抗原結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)僅克隆1表達出了能與角蛋白抗原特異性結(jié)合的Fba抗體，另3個克隆所表達的Fab不能與角蛋白抗原結(jié)合見表6。表中的陽性對照為從人外周血提取的多克隆抗角蛋白抗體(gIG一AKuatoAb)

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2814054