乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)可引起人類的急、慢性乙型肝炎，而且與肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生有十分密切的關(guān)系，對人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。HBV具有宿主特異性，在自然情況下，HBV不感染醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)哺乳動物——小鼠，80年代中期，由于轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的應(yīng)用，乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠模型陸續(xù)地在一些發(fā)達(dá)國家和地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室里出現(xiàn)。由于知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)以及專利制度等多種因素的限制，我國一直未能引進(jìn)國外的全基因組乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠品系。因此，盡快在我國自行建立一個(gè)符合國際標(biāo)準(zhǔn)的、可大規(guī)模推廣應(yīng)用的乙肝全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠模型是十分必要的。另外，由于HBV有至少4種血清亞型(adr、ayr、adw和ayw)，它們在基因組結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性和流行地域等方面都存在著一定的差異。在我國流行的主要是adr亞型，所以，我們需要的動物模型應(yīng)該是相對應(yīng)的adr亞型的乙肝全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠模型。本課題就是利用我們實(shí)驗(yàn)室建立并優(yōu)選的乙肝全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU“3號”品系的F6-F17代小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，從DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒學(xué)、病理學(xué)和免疫學(xué)角度，綜合研究了該品系轉(zhuǎn)基因小鼠的生物學(xué)特性，使其成為可應(yīng)用于乙型肝炎病毒相關(guān)研究的實(shí)驗(yàn)動物模型。 本研究采用基因組DNA PCR、Southem blotting和DNA測序的方法，分析了HBV基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中的整合特征，結(jié)果表明，adr亞型的乙型肝炎病毒全基因組轉(zhuǎn)基因已穩(wěn)定的整合在轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組中，并能通過生殖系以孟德爾遺傳方式在世代間穩(wěn)定遺傳。利用RT-PCR和real-time RT-PCR對轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中的總RNA進(jìn)行定性和半定量檢測，分析了HBV基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中的轉(zhuǎn)錄特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠中整合的HBV基因能夠轉(zhuǎn)錄出病毒的所有mRNAs，病毒mRNA的半定量檢測可用于評價(jià)抗病毒治療的研究，是評價(jià)該轉(zhuǎn)基因小鼠的重要指標(biāo)之一。通過免疫組織化學(xué)、血清ELISA和Western blotting方法，分析了HBV基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá)和分泌特征。肝組織免疫組織化學(xué)分析顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞中表達(dá)HBsAg、HBcAg和X蛋白三種病毒蛋白，但并不是所有的肝細(xì)胞同時(shí)表達(dá)HBsAg、HBcAg和X蛋白。三種病毒蛋白的檢出率分別為：85.82％(HBsAg)、58.25％(HBcAg)和49.61％(X蛋白)，HBsAg分布于肝細(xì)胞質(zhì)中； 勺r叼匕洲博d匕學(xué)位論文 乙習(xí)跳刀千失病毒全基因啟區(qū)粉吞因小民的生物學(xué)特性減玲究 HBcAg和x蛋白既可分布于肝細(xì)胞核中，也可分布于肝細(xì)胞質(zhì)中。免疫組織化學(xué) 檢測可直觀的反映轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)病毒蛋白的表達(dá)情況，也是評價(jià)該轉(zhuǎn)基因小鼠 的重要指標(biāo)之一。血清EuSA和認(rèn)觸ste訊blo翻誼g分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)荃因小鼠肝細(xì)胞中 表達(dá)的病毒蛋白可分泌入血，小鼠血清中HBSAg和HBeAg的檢出率分別為: 55.20Ok和25.000/0，但HBsAg和HBeAg的存在時(shí)間和水平并不同步，具有明顯的 個(gè)體差異，另外，轉(zhuǎn)基因小鼠中HBsAg的表達(dá)還具有發(fā)育調(diào)節(jié)和性別相關(guān)性。采 用血清DNA PCR、reai一me PCR的方法，分析了轉(zhuǎn)基因小鼠中1{BV的復(fù)制、病 毒顆粒的包裝和分泌特征。對小鼠血清DNA進(jìn)行PCR和real一time PCR分析發(fā)現(xiàn)， 轉(zhuǎn)基因小鼠血清中存在HBV DNA，其含量達(dá)到臨床患者陽性標(biāo)準(zhǔn)，表明轉(zhuǎn)基因小 鼠中整合的HBV基因組DNA可復(fù)制包裝成病毒顆粒并分泌入血。血清中HBV DNA的定量檢測簡便準(zhǔn)確，也可用于評價(jià)抗病毒治療的研究，是評價(jià)該轉(zhuǎn)基因小 鼠的重要指標(biāo)之一。 我們進(jìn)一步對該品系轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了組織病理學(xué)、血清酶學(xué)和免疫學(xué)的檢 測，分析了轉(zhuǎn)基因小鼠的病理學(xué)和免疫學(xué)特征。肝組織H一E染色分析發(fā)現(xiàn)，部分 轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中出現(xiàn)了不同程度的肝細(xì)胞變性(45.52%)、肝細(xì)胞壞死區(qū)和匯 管區(qū)數(shù)量不等的單個(gè)核細(xì)胞浸潤(47.01%)。浸銀染色分析發(fā)現(xiàn)，29.10%(3 9/134) 的轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織出現(xiàn)了纖維組織增生，特別是單個(gè)核細(xì)胞浸潤處。肝細(xì)胞的 這種病理損傷與轉(zhuǎn)基因小鼠的月齡密切相關(guān)，隨著月齡的增加，轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟 損傷的發(fā)生率和嚴(yán)重程度均增加;另外，肝細(xì)胞的變性還與病毒蛋白的表達(dá)成負(fù) 相關(guān)。透射電鏡分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠肝腎臟組織發(fā)生了超微病理損傷，主要有: 線粒體腫脹、線粒體晴消失、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、髓樣體結(jié)構(gòu)形成、膠原纖維增生。肝 組織中還有糖原增加、脂滴儲積、部分肝細(xì)胞溶解等慢性損傷的超微病理改變; 而腎臟則出現(xiàn)了基底膜增厚、釘突消失、基底膜上出現(xiàn)沉積物、部分細(xì)胞核空泡 樣變性等變化。血清酶學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，少數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT和AST) 升高。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生了與人類慢性HBV無癥狀攜帶者相似的肝 組織病理性損傷，總體為輕度慢性肝炎。采用流式細(xì)胞術(shù)對該品系轉(zhuǎn)基因小鼠外 周血T淋巴細(xì)胞及其亞群分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠外周血CD獷、CD4+、CDS+T細(xì) 胞和CD4勺CDS+均下降;免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，肝組織中浸潤的單個(gè)核細(xì)胞CD3 常二二潤民吸大學(xué)細(xì)鹿生物攀欲戈開宜 份曉淵俘創(chuàng)匕學(xué)位論文 乙裂樸炎漪每苦卜刃‘因粗轉(zhuǎn)蘇因小且的生物學(xué)特性月開究 和CD4陽性，CDS和CD57陰性:血清ELISA分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠血清A刀ti一HB示 Anti一HBc、Anti一HBe陰性。 本課題的研究表明，我們建立的乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠C57
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R-332
【部分圖文】：

份曉洲俘d匕學(xué)位論文乙裂月干炎清毒全基因月巨轉(zhuǎn)基因小旅的生物學(xué)特性籠開究二、乙型肝炎病毒基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中轉(zhuǎn)錄隨機(jī)抽取5只PCR陽性的3號品系HBV全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠，剪取少許組織塊進(jìn)行總RNA抽提(圖7)，通過RT-PCR的方法檢測轉(zhuǎn)基因小鼠中是否HBvDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中有:基因(圖8)、x基因尸理功基因和。基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(照片未顯示)，表明整合在轉(zhuǎn)基因小鼠中的HBvDNA可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的mRNAS。進(jìn)一步用real一meRl’-PCR的方法對7只轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中的HBVc基mRNA進(jìn)行半定量的分析，結(jié)果顯示，7只轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中均存在HBcmRNA，但不同小鼠之間mRNA的含量有差別(圖9)，進(jìn)一步證實(shí)整合的HBVDNA可轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA，但轉(zhuǎn)基因小鼠個(gè)體間存在差異。

助al一imeRT-PCR結(jié)果(c墓因)

圖15轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中A:正常對照;E，F(xiàn):轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中HBsAg、HBcAg和X蛋白的表達(dá)日，C，O:轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中HBsAg的表達(dá);HBCAg的表達(dá);G，H:轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中X蛋白的表達(dá)第二二軍醫(yī)大學(xué)細(xì)脆生物學(xué)教研室37

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本文編號：2812522