第一部分棕櫚酸誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞H9c2凋亡作用機(jī)制研究 研究背景和目的： 心肌細(xì)胞凋亡是造成心肌功能紊亂、心力衰竭等心血管疾病的重要因素。研究表明,在高濃度游離飽和脂肪酸(如棕櫚酸)的作用條件下會(huì)造成脂毒性心肌病,從而引起心肌細(xì)胞的凋亡。然而,這種高濃度飽和脂肪酸導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚不明確。本部分的研究擬在體外用高濃度棕櫚酸誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞H9c2,建立高濃度棕櫚酸誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡模型,觀察棕櫚酸對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響,并探討棕櫚酸造成心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。 研究方法： 用不同棕櫚酸濃度誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞H9c2凋亡,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性；Hoechst33342熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡；利用DCFH-DA熒光探針原位檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。用Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、PARP、BAX、Bcl-2、p53及相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)水平的變化。 研究結(jié)果： 不同濃度棕櫚酸作用于H9c2細(xì)胞12h,與對(duì)照組相比,高濃度棕櫚酸誘導(dǎo)后細(xì)胞活性明顯降低(P0.05),細(xì)胞凋亡明顯增加(P0.05),凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和PARP的活性蛋白表達(dá)明顯增加(P0.05),同時(shí)p53蛋白、BAX蛋白的表達(dá)也明顯增加(P0.05),而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P0.05)。高濃度棕櫚酸誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡,伴隨細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高(P0.05)、ERK1/2信號(hào)分子的磷酸化水平也明顯上調(diào)(P0.05),而Akt信號(hào)分子磷酸化水平明顯降低(P0.05)。ERK1/2抑制劑能通過抑制ERK1/2信號(hào)活性部分降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平,從而減弱棕櫚酸誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。 研究結(jié)論： 高濃度棕櫚酸誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞H9c2后,通過降低Akt信號(hào)通路的活性、激活ERK1/2信號(hào)通路和增加細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量造成的氧化應(yīng)激,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和PARP等蛋白的活化,最終引起細(xì)胞凋亡。本研究的結(jié)果明確了ERK1/2信號(hào)通路和ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激機(jī)制在棕櫚酸誘導(dǎo)脂毒性心肌病上的作用,為脂毒性心肌病的相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第二部分脂聯(lián)素抵抗棕櫚酸誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞H9c2凋亡作用機(jī)制研究 研究背景和目的： 脂聯(lián)素是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的蛋白質(zhì)激素,主要由脂肪組織分泌,其在保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功能、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、直接或間接保護(hù)心肌細(xì)胞凋亡等中發(fā)揮重要作用。脂質(zhì)在心臟中的過度累積會(huì)造成心肌功能紊亂和心力衰竭。研究顯示,在心肌功能紊亂和心力衰竭患者中,其游離飽和脂肪酸的水平明顯升高。心肌細(xì)胞凋亡是心肌功能紊亂和心力衰竭的重要因素,防止心肌細(xì)胞凋亡可以明顯改善心肌功能紊亂。脂聯(lián)素具有保護(hù)心肌功能和抵抗心肌細(xì)胞凋亡的效應(yīng),但這種保護(hù)效應(yīng)的分子機(jī)制尚不明確。本部分的研究擬在體外以高濃度棕櫚酸誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞H9c2凋亡,探討脂聯(lián)素抵抗棕櫚酸誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡的效應(yīng)以及相關(guān)分子機(jī)制。 研究方法： 高濃度棕櫚酸或高濃度棕櫚酸聯(lián)合2.5μg/ml球狀脂聯(lián)素的條件下誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞12h。用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性,用Hoechst33342檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,用DCFH-DA熒光探針原位檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平改變,用RT-PCR檢測(cè)炎癥相關(guān)因子IL6、CRP和ICAM的mRNA表達(dá)變化,用Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白及相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)水平變化情況。 研究結(jié)果： 與單純的高濃度棕櫚酸相比,高濃度棕櫚酸聯(lián)合2.5μg/ml球狀脂聯(lián)素的作用下,細(xì)胞活性明顯增加(P0.05),細(xì)胞凋亡明顯減少(P0.05),伴隨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和PARP活性蛋白表達(dá)明顯降低(P0.05),炎癥相關(guān)因子IL6、CRP和ICAM的mRNA表達(dá)水平明顯降低(P0.05),細(xì)胞內(nèi)ROS也比單純高濃度棕櫚酸作用的水平明顯降低(P0.05)。同時(shí),相關(guān)信號(hào)分子p-ERK1/2水平明顯降低(P0.05)、p-Akt水平明顯升高(P0.05)。PI3K/Akt抑制劑LY294002能明顯減弱脂聯(lián)素抵抗高濃度棕櫚酸誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞的凋亡,ERK1/2抑制劑U0126作用下也可明顯降低棕櫚酸誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞的凋亡 研究結(jié)論： 球狀脂聯(lián)素可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路以及抑制ERK1/2/MAPK信號(hào)通路的活性,降低凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和PARP的活性,減少ROS造成的氧化應(yīng)激,從而抵抗高濃度棕櫚酸誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡。本研究不僅闡述脂聯(lián)素介導(dǎo)抵抗心肌細(xì)胞凋亡作用的相關(guān)分子機(jī)制,同時(shí)也為脂聯(lián)素可能作為脂毒性心肌病的治療藥物提供有價(jià)值的依據(jù)。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R363

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本文編號(hào)：2812440