發(fā)布時間：2020-08-31 16:45

　　 第一部分 穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的McA-RH7777細胞株的建立及生物學(xué)特性評價 目的： 構(gòu)建穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的McA-RH7777細胞株,并對其生物學(xué)特性進行評價。方法： 通過對慢病毒載體包裝,將攜帶增強型綠色熒光蛋白(enhance green fluores-cent protein, EGFP)的慢病毒轉(zhuǎn)染McA-RH7777細胞株,并進行篩選和單克隆化,構(gòu)建出表達綠色熒光蛋白的單克隆細胞株：McA-RH7777/EGFP。體外多次傳代后檢測該細胞株熒光表達的穩(wěn)定性；對McA-RH7777和McA-RH7777/EGFP兩種細胞株在細胞生長、細胞周期、遷移運動能力、侵襲能力、AFP的表達及體內(nèi)成瘤方面進行觀察,判斷經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后構(gòu)建的細胞株較McA-RH7777細胞株的生物學(xué)特性是否改變。 結(jié)果： 通過慢病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染McA-RH7777細胞株實驗過程順利,經(jīng)過篩選和單克隆化建立的McA-RH7777/EGFP細胞株,能夠體外穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白。經(jīng)過180天體外培養(yǎng)后,仍能穩(wěn)定表達綠色熒光,流式細胞儀檢測表達率達到100%；細胞形態(tài)較轉(zhuǎn)染前未發(fā)生改變。McA-RH7777/EGFP細胞株的生長曲線、細胞周期、遷移運動能力、侵襲能力、AFP的表達與McA-RH7777細胞株基本一致。將McA-RH7777/EGFP細胞注入Buffalo大鼠皮下,建立皮下瘤,顯示成瘤率、腫瘤生長趨勢與McA-RH7777細胞基本一致。 結(jié)論： 通過慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法建立起來的McA-RH7777/EGFP細胞株能穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白,細胞生物學(xué)特性與母系細胞株基本一致,為肝癌的基礎(chǔ)研究提供了一個良好的細胞株。 第二部分穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的肝癌大鼠模型的建立及相關(guān)特性評價 目的： 建立穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的肝癌大鼠移植瘤模型,并評價該模型的生物學(xué)特性,為肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、介入治療等研究提供一個重要的動物模型。 方法： 利用McA-RH7777/EGFP細胞株皮下注射成瘤后,制備瘤塊。取30只Buffalo大鼠,開腹直視下,將瘤組織塊種植到肝臟。造模后第7天行MRI掃描檢查肝內(nèi)成瘤率。觀察荷瘤鼠的生物學(xué)特征變化,了解其轉(zhuǎn)移特性；在小動物成像儀及熒光顯微鏡下觀察熒光表達的穩(wěn)定性及評價熒光在腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)研究中的優(yōu)勢；病理學(xué)及免疫印跡分析觀察腫瘤組織特點及腫瘤指標的表達情況；行MRI、CT、DSA檢查來評價該腫瘤模型的影像學(xué)特點。 結(jié)果： 該模型造模成功率高,達到100%。大鼠生存期為45.93±5.06天。大鼠肝內(nèi)腫瘤體積第7天時為12.54±3.89mm3,14天時201.18±86.39mm3,較前明顯增大,之后增長迅速。終末期觀察該肝癌模型具有高肺轉(zhuǎn)移特性,腫瘤組織熒光表達穩(wěn)定,在熒光顯微鏡下可以清楚的區(qū)分腫瘤病灶,病理符合肝癌表現(xiàn)。AFP表達陽性。腫瘤在MRI上T1WI上成像稍低或等信號,而在T2WI上呈高信號;CT顯示肝內(nèi)病灶為低密度,肺部多發(fā)結(jié)節(jié)狀轉(zhuǎn)移灶；DSA造影顯示肝內(nèi)腫瘤供血動脈增粗,血管扭曲,腫瘤染色明顯,與人類肝癌影像學(xué)表現(xiàn)相似。 結(jié)論： 穩(wěn)定表達EGFP的肝癌Buffalo大鼠移植瘤模型和人類的肝癌的生物學(xué)特性接近,具有成瘤率高、重復(fù)性強、高肺轉(zhuǎn)移等特性,熒光表達穩(wěn)定,適合用于肝癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、介入治療、影像診斷、新藥篩選等方面的實驗研究。 第三部分 大鼠移植性肝癌模型腫瘤分期的初步探討 目的： 通過觀察穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的肝癌Buffalo大鼠模型腫瘤的進展過程,確定大鼠肝癌模型的腫瘤分期,探討微轉(zhuǎn)移期的時間窗。 方法： 利用McA-RH7777/EGFP細胞株皮下注射成瘤后,制備瘤塊。取35只Buffalo大鼠,開腹直視下,將瘤組織塊種植到肝臟,造成大鼠肝癌模型。觀察大鼠的生物學(xué)行為,并根據(jù)該模型的生長特點及大鼠腫瘤的進展情況,于7、12、18、21、26天分別處死7只大鼠,利用腫瘤細胞表達熒光的特點,在熒光顯微鏡下準確的觀察肝內(nèi)腫瘤生長情況、肺轉(zhuǎn)移情況。在處死大鼠時取下腔靜脈血,流式細胞儀檢測大鼠循環(huán)腫瘤細胞的變化,并檢測肝功能中白蛋白的變化。通過綜合上述因素,來確定大鼠的腫瘤分期。 結(jié)果： 造模后7天,行MRI掃描,Buffalo大鼠肝內(nèi)均有腫瘤,造模成功。造模后大鼠體重7天內(nèi)增長不明顯,之后開始增加；至21天體重增加不明顯,隨后開始下降。肝內(nèi)腫瘤第7天時為13.36±2.90mm3,12天時162.5±69.71mm3,26天達到1683.36±375.02mm3。觀察肝外轉(zhuǎn)移情況：21天時肺部出現(xiàn)熒光顯微鏡下可見的小轉(zhuǎn)移灶,之前肺部未見轉(zhuǎn)移灶；26天時肺部出現(xiàn)肉眼可見多發(fā)小轉(zhuǎn)移灶。循環(huán)腫瘤細胞檢測發(fā)現(xiàn)：第7天未能檢測到腫瘤細胞,12天腫瘤細胞數(shù)為(8.14±1.21)/106,18天時腫瘤細胞數(shù)為(15.43±3.99)/106,P0.05。肝功能檢測發(fā)現(xiàn)26天時ALB為28.8±2.85g/L,較前下降,P0.05。 結(jié)論： 在穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的肝癌Buffalo大鼠模型上從12天到18天可定義為微轉(zhuǎn)移期肝癌,21天后為晚期肝癌。該分期情況可以為肝癌的動物實驗研究提供一定的參考。 第四部分 經(jīng)動脈栓塞術(shù)對微轉(zhuǎn)移期肝癌肺轉(zhuǎn)移影響的實驗研究 目的： 對微轉(zhuǎn)移期的肝癌大鼠進行經(jīng)動脈栓塞治療,探討栓塞治療對于該時期肝癌肺轉(zhuǎn)移的影響,并對其機制進行初步研究,為臨床更科學(xué)的設(shè)計治療方案提供參考。 方法： 取40只Buffalo大鼠,開腹直視下,將瘤組織塊種植到肝臟,建立穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的肝癌大鼠模型。造模后第17天,將大鼠隨機分成4組,每組10只,分別為：對照組(A),開腹胃十二指腸動脈逆行插管成功后,注入生理鹽水0.2ml;肝動脈結(jié)扎組(B),分離肝動脈后采用縫線結(jié)扎；小劑量栓塞組(C),胃十二指腸動脈逆行插管,注入超液化碘油(0.2ml/kg)；大劑量栓塞組(D)：胃十二指腸動脈逆行插管,注入超液化碘油(0.4ml/kg)。術(shù)后隨訪體重及腫瘤變化,三周后處死所有大鼠,收集肝和肺標本,觀察腫瘤生長變化及肺轉(zhuǎn)移情況。通過進行Real time PCR、Western-blot、免疫組化來檢測腫瘤組織中的VEGF、 E-cadherin、ICAM-1在mRNA及蛋白水平表達的差異。 結(jié)果： 術(shù)后第7、14、21天,記錄肝內(nèi)腫瘤情況顯示：D組明顯抑制肝臟腫瘤生長,B、C組相對于對照組也有抑制生長。觀察肺轉(zhuǎn)移：D組肺轉(zhuǎn)移個數(shù)相對較少。 通過RT-PCR比較各組VEGF mRNA的相對表達量：B、C、D組的VEGF mRNA相對表達量,分別為2.53±0.28、2.46±0.32、1.95±0.17,均較A組(0.93±0.29)表達量高,有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。Western-blot分析VEGF結(jié)果顯示：A組為0.17±±0.01,較B(0.28±0.05)、C(0.27±0.07)、D(0.21±0.04)三組表達低,有統(tǒng)計學(xué)差異,P0.05。免疫組化染色記錄陽性細胞數(shù)百分比顯示A、B、C、D四組分別為：46.8±6.05、63.8±7.09、61.3±3.82、51.4±4.5,相互比較發(fā)現(xiàn)：A組較B、C組低,P值均小于0.04；但A、D之間無顯著差異,P0.05。腫瘤內(nèi)CD31標記的陽性血管數(shù)顯示：B(57.1±6.9)、C(52.3±2.7)組較A(43.3±3.7)、D(45.5±3.5)組高,有統(tǒng)計學(xué)差異,P0.05。 通過RT-PCR分析四組E-cadherin mRNA的相對表達量：D組(1.66±0.38)較A(0.99±0.39)、B(0.80±0.23)、C(0.86±0.24)三組表達增高,均有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。Western-blot分析E-cadherin結(jié)果顯示A、B、C、D四組分別為：0.13±±0.06、0.12±0.04、0.13±0.03、0.32±0.09,D組較A、B、C三組高,有統(tǒng)計學(xué)意義,P值均小于0.003。免疫組化染色計數(shù)陽性細胞率發(fā)現(xiàn)結(jié)果同Western-blot結(jié)果相似。 通過RT-PCR分析ICAM-1mRNA的相對表達量顯示A、B、C、D四組分別為：1.09±0.19、1.12±0.16、0.97±0.23、0.69±0.16,D組較其他三組降低,P0.05。Western-blot分析ICAM-1結(jié)果顯示：D組(0.27±0.05)較A(0.41±0.08)、B(0.44±0.09)、C(0.40±0.06)三組降低,P0.05。 結(jié)論： 在大鼠肝癌模型上,經(jīng)動脈栓塞治療微轉(zhuǎn)移期肝癌,大劑量的碘油栓塞能抑制腫瘤生長,降低肺轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R735.7;R445.2;R-332

【參考文獻】

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1 盧偉,李彥豪,何曉峰,陳勇,曾慶樂,裘玉容;經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞術(shù)中化療藥物劑量對肝癌患者T細胞亞群的影響[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2002年06期

2 ;Suicide gene therapy of hepatocellular carcinoma and delivery procedure and route of therapeutic gene in vivo[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2002年03期

3 ;Quantitative analysis of vascular endothelial growth factor, microvascular density and their clinicopathologic features in human hepatocellular carcinoma[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2005年02期

4 Timm D Kirchhoff;Joerg S Bleck;Arne Dettmer;Ajay Chavan;Herbert Rosenthal;Sonja Merkesdal;Bernd Frericks;Lars Zender;Nisar P Malek;Tim F Greten;Stefan Kubicka;Michael P Manns;Michael Galanski;;Transarterial chemoembolization using degradable starch microspheres and iodized oil in the treatment of advanced hepatocellular carcinoma: evaluation of tumor response, toxicity, and survival[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2007年03期

5 Wan-Yee Lau;Eric C. H. Lai;;Hepatocellular carcinoma: current management and recent advances[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2008年03期

6 王耀恒;;連續(xù)經(jīng)導(dǎo)管動脈化療性栓塞+射頻消融與單純射頻消融對復(fù)發(fā)性肝細胞癌療效的前瞻性隨機研究[J];國際醫(yī)學(xué)放射學(xué)雜志;2012年02期

7 肖恩華,李錦清,黃潔夫;術(shù)前經(jīng)動脈化療栓塞對肝癌細胞增殖的影響[J];介入放射學(xué)雜志;2004年01期

8 楊甲梅;沈偉峰;;肝癌的介入治療[J];臨床外科雜志;2006年10期

9 劉謹文;易繼林;;Relationship between the Changes of VEGF Level and Dendritic Cells in Peripheral Blood of Patients with Hepatocellular Carcinoma after Transcatheter Arterial Chemoembolization[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2007年01期

10 ;Multimodality treatment in hepatocellular carcinoma patients with tumor thrombi in portal vein[J];World Journal of Gastroenterology;2001年01期

本文編號：2809068