目的 研究人外周血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DC） 體外誘導(dǎo)、擴增方法以及生物學(xué)特性，進(jìn)一步在體外和動物模型上研 究DC在抗乙肝病毒和肝癌免疫中的作用，為DC疫苗在臨床上的應(yīng)用提 供理論依據(jù)。 方法 1．人外周血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞體外誘生方法和生物學(xué)特性 1．1 從健康人外周血中分離出單核細(xì)胞，在rhGM-CSF和rhIL-4的 作用下培養(yǎng)7-22天，并通過形態(tài)學(xué)觀察、FACS分析（檢測DC 表面特異性標(biāo)記CDla及DC功能相關(guān)分子HLA-ABC、HLA-DR、 CD40、CD86的表達(dá)）和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行鑒定。 1．2 EBV感染PBMC建立EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞系，用該細(xì)胞和DC 負(fù)載抗原后刺激自體淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)來比較兩種細(xì)胞的抗 原提呈能力。 2．DC抗乙肝病毒免疫 2．1 取正常人和慢性乙肝病人的外周血，按前述方法誘導(dǎo)擴增出DC， 并用流式細(xì)胞儀檢測CD40表達(dá)情況。 重慶醫(yī)科人學(xué)博卜學(xué)位論義 2．2檢測乙肝表面抗原＊BSAg）負(fù)載的 DC刺激自體淋巴細(xì)胞增殖 效應(yīng)。 2．3用PLXSN＊真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HepGZ 細(xì)胞，建立表達(dá)HBsAg的 。靶細(xì)胞摸型；檢測DC誘寺的HBsAg特并性CTI。對HePGZ—S細(xì)胞 的殺傷效應(yīng)。 2．4用HBsAg特異性CTL與HepG。＊細(xì)胞同時接種BALB／C裸鼠或用 HBsAg特異性CTL治療HepG。上荷瘤裸鼠模型，觀察腫瘤的發(fā)生 和生長情況u瘤大小用最大徑與最小徑的乘積來表示，nz）。 3．DC抗肝細(xì)胞癌免疫 3．l 從健康人外周血中分離出單核細(xì)胞，在rhG卜CSF和 rhIL叫或 rhGM｛SF作用下培養(yǎng)7天，分別誘導(dǎo)出同一個體來源的DC和巨 噬細(xì)胞＊巾人 用腫瘤抗原負(fù)載的細(xì)胞刺激自體淋巴細(xì)胞增殖 效應(yīng)來比較兩種細(xì)胞對肝癌細(xì)胞抗原＊）的提呈作用。 3．2 DC體外激活產(chǎn)生腫瘤特異性CTL并檢狽對CTL對HepGZ 細(xì)胞的 殺傷效應(yīng)。 3．3用HepGZ細(xì)胞接種于裸鼠背部皮下，建立肝癌細(xì)胞荷瘤裸鼠模 型：OC激活的腫瘤特異性CTL和LAK細(xì)胞分別對He＊2荷瘤裸 e 鼠模型進(jìn)行治療，比較它們的治療效果。 結(jié)果 1．人外周血單核細(xì)胞來源DC的鑒定和生物學(xué)特性 1．1 在枷｛SF和IL、作用－卜，培養(yǎng)7天即可誘導(dǎo)出典型的＊。經(jīng) 3 罩慶醫(yī)科大學(xué)博I＿學(xué)位論義 ＊W 光學(xué)顯微鏡和電鏡觀察及流式細(xì)胞儀分析證實，所誘導(dǎo)的細(xì)胞 具有典型DC 的形態(tài)學(xué)和結(jié)構(gòu)特征；表達(dá)DC特異性表面標(biāo)記 CDla，同時高表達(dá)功能十關(guān)分于HI。A－ABC、HLA－DR，CD40于 CD86； ．混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的檢測表明，DC具有較強的刺激同種淋巴細(xì) 胞反應(yīng)的能力。 1．2負(fù)載抗原的DC刺激自體淋巴細(xì)胞增殖的能力強于朋V轉(zhuǎn)化的淋 巴母細(xì)胞，說明DC具有更強的抗原提呈能力。 2．DC抗乙肝病毒免疫 2．IHBSAg負(fù)載的m不僅誘導(dǎo)自體淋巴細(xì)胞增殖，而且其激活的 HBSAg特異性CTL具有很強的殺傷效應(yīng)，殺傷率為85．l鞏 2．2在接種后的 22大內(nèi)，預(yù)防接種組荷瘤率為 20％門乃），而對照 組為90％（9／10），有顯著性差異（g（。05）；DC激活的HBSAg 特異性CTL對HepG廠S荷瘤鼠模型有治療作用，在接種后的38 大內(nèi)，治療組腫瘤明顯比對照組小，有顯著性差異k們．05）， 而且治療組有 3只荷瘤鼠腫瘤消退“0們。 3．DC抗肝細(xì)胞癌免疫 3．1被肝癌細(xì)胞抗原致敏的隊或M巾有顯著刺激自體淋巴細(xì)胞增殖 元 效應(yīng)，而以DC的刺激能力更強c 3．2 DC激活的腫瘤特異性 CTL具有很強的殺傷效應(yīng)，殺傷率為 71．6耿 3．3 DC激活的腫瘤特異性 CTL有抑制腫瘤生長的作用，明顯強于 LAK 細(xì)胞的治療效果b州．05人 4 重慶醫(yī)科大學(xué)博十學(xué)位論文 結(jié)論 1．人外周血單核細(xì)胞在GM｛SF和 IL個的誘導(dǎo)下，可以分化為典型的 樹突狀細(xì)胞，并具有較強的抗原提呈功能。 2．立表達(dá)HBSAg的肝癌細(xì)胞荷瘤裸鼠模型，通過觀察HBSAg
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2001
【中圖分類】：R392.12;R73-36

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本文編號：2809021