發(fā)布時間：2020-08-28 19:41

　　 隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，脂肪和糖類的過多攝入，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)病率呈逐年增高趨勢。NAFLD主要包括，單純脂肪變性、非酒精性脂肪肝炎和肝硬化。某些病例還與肝臟腫瘤有關(guān)�！岸未驌簟睂W說被認為是其主要發(fā)病機制，但仍不十分清楚，目前有效的治療藥物也較少。 核因子相關(guān)因子-2(NF-E2-related Factor2,Nrf2)，幾乎存在各種細胞中，其作用引起了國內(nèi)外廣泛的研究。許多文獻表明其在肝臟的相關(guān)疾病中，起著重要的作用。Nrf2可以通過調(diào)控細胞內(nèi)抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶來抵抗氧化應(yīng)激、減輕肝臟炎癥、對抗肝細胞凋亡等。作為生物體主要的Ⅰ相代謝酶，CYP2A5是肝微粒體混合功能氧化酶系中最重要的一種，不僅與藥物的生物轉(zhuǎn)化等代謝環(huán)節(jié)密切相關(guān)，也和某些疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究表明，直接或間接由各種毒性化學物質(zhì)或疾病引起的肝損傷，在炎癥或肝硬化區(qū)域相鄰的肝細胞CYP2A5是呈現(xiàn)增量表達。鎘誘導氧化應(yīng)激中，野生型小鼠肝細胞CYP2A5表達升高，而Nrf2敲除小鼠肝細胞CYP2A5表達沒有變化。本實驗前期研究結(jié)果已經(jīng)證明，非酒精性脂肪肝模型鼠肝臟CYP2A5的表達量顯著升高。但研究其兩者在非酒精性脂肪肝發(fā)病過程中的變化及其相互影響，鮮有報道。 為了探索非酒精性脂肪肝誘導的CYP2A5增量表達與Nrf2的相關(guān)性，本試驗以野生型和敲除Nrf2的ICR小鼠為實驗動物，根據(jù)前期建立的非酒精性脂肪肝模型的方法，采用高脂飼料配方建立小鼠非酒精性脂肪肝模型，采用免疫組化法研究非酒精性脂肪肝模型鼠肝細胞中Nrf2與CYP2A5的表達關(guān)系以及敲除Nrf2基因?qū)Ψ蔷凭灾靖尾l件下CYP2A5表達的調(diào)控作用。將實驗動物隨機分為野生型高脂組（WT-HFD）、野生型對照組（WT-ND）、Nrf2敲除高脂組（KO-HFD）和Nrf2敲除對照組（KO-ND），分別飼喂高脂飼料或普通標準飼料。分別在4、6、8周剖殺部分小鼠，根據(jù)小鼠的血清生化指標、肝指數(shù)、肝臟病理組織學變化等指標評價模型鼠隨疾病進程的發(fā)展而發(fā)生的變化。比較KO-HFD小鼠與WT-HFD小鼠疾病進程，分析Nrf2對疾病的影響。采用免疫組化方法分析野生型小鼠和Nrf2基因敲除鼠肝臟中CYP2A5的表達量隨疾病進程發(fā)展發(fā)生變化以及Nrf2對CYP2A5表達的影響。 研究結(jié)果表明： （1）采用高脂飼料連續(xù)飼喂8周，小鼠血清生化指標和脂質(zhì)發(fā)生明顯的改變。其中血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、總膽固醇(T-Chol)、低密度脂蛋白(LDL)和葡糖糖（GLU）均呈升高趨勢；但甘油三酯(TG)為降低趨勢。WT-HFD和KO-HFD小鼠血清中ALT、AST與T-Chol，與各自對照組相比，極顯著升高。在4、6、8周時，KO-HFD小鼠的血清中ALT、AST、T-Chol及GLU含量要顯著高于WT-HFD小鼠�？梢奛rf2對NAFLD疾病發(fā)展有明顯影響。KO-HFD小鼠ALT和T-Chol含量，8周顯著高于4周，總體呈升高趨勢。WT-HFD小鼠T-Chol含量，8周時顯著高于4、6周。 （2）病理組織學結(jié)果顯示，4-8周時與各自對照組相比，KO-HFD小鼠和WT-HFD小鼠肝組織出現(xiàn)顯著的脂肪變性，以中央靜脈周圍為主，多為大、小泡混合型脂肪變性，可見炎性細胞浸潤。在6-8周時KO-HFD小鼠脂肪變性和炎癥活動顯著高于WT-HFD小鼠。8周時，相比WT-ND小鼠，KO-ND小鼠肝臟中有脂肪顆粒，但不顯著。提示Nrf2與非酒精性脂肪肝的發(fā)病機制有關(guān)系，Nrf2可能保護肝臟降低NAFLD中脂肪變性程度；敲除Nrf2會影響小鼠脂質(zhì)代謝。8周的WT-HFD小鼠肝臟脂肪變性程度極顯著大于4、6周WT-HFD小鼠，而4與6周WT-HFD鼠的脂肪變性程度差異不顯著；4-8周各組KO-HFD小鼠的肝臟脂肪變性程度差異極顯著。4-8周時，WT-HFD各組肝臟炎癥活動度差異顯著；KO-HFD小鼠肝臟炎癥活動度8周時顯著高于6周，且8、6周極顯著高于4周。 （3）相比WT-ND小鼠，WT-HFD小鼠肝臟中Nrf2和CYP2A5表達量極顯著升高。4-8周，WT-HFD各組小鼠肝臟中Nrf2表達量呈極顯著的升高；4-8周，WT-HFD各組小鼠肝臟中CYP2A5表達呈顯著上升，Nrf2與CYP2A5的表達呈正相關(guān)性。 （4）4-8周時，KO-ND小鼠肝臟中CYP2A5的表達低于WT-ND小鼠，但差異不顯著；4-8周時，KO-HFD小鼠肝臟中CYP2A5的表達量極顯著低于WT-HFD小鼠。在Nrf2敲除小鼠中沒有檢測到Nrf2的陽性表達。提示抑制Nrf2表達，CYP2A5的表達量降低，Nrf2在非酒精性脂肪肝中調(diào)控CYP2A5的表達；相比于KO-ND，KO-HFD小鼠中CYP2A5表達量略有升高，但不顯著，提示CYP2A5的調(diào)控還可能涉及除Nrf2以外的其他轉(zhuǎn)錄或調(diào)節(jié)因子。 本試驗在成功建立小鼠NAFLD模型的基礎(chǔ)上，旨在檢測各組小鼠肝臟組織中Nrf2和CYP2A5的表達情況，研究NAFLD模型小鼠肝臟組織的Nrf2和CYP2A5的相互關(guān)系，以及可能引起這些變化的因素，如脂肪酸蓄積、脂肪變性和炎癥等，從而探討Nrf2和CYP2A5在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的相互作用機制。同時為NAFLD新藥的研制和開發(fā)提供新的線索。
【學位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R575.5;R-332
【部分圖文】：

0246810WT-ND KO-ND WT-HFD KO-HFDLU（Gmol/L）m468AB BCB圖 3-13 高脂飼料對小鼠血清中 GLU 的影響Fig3-13 Effect of High-fatty-diet on serum GLU in mice3.3 病理學觀察3.3.1 高脂飼料對肝臟眼觀的影響從肝臟外觀來看，對照組小鼠肝臟大小顏色正常，肝臟邊緣整齊，呈紅褐色，有彈性；T-HFD 和 KO-HFD 小鼠肝臟發(fā)生明顯的變化，體積變大，有油膩感，顏色呈灰黃色，腫大碎。并且飼喂高脂后，膽囊變大，膽囊中有顆粒物。WT-HFD 和 KO-HFD 小鼠肝臟外觀差不明顯。在部分 KO-HFD 小鼠肝臟有小出血點。結(jié)果見圖 3-14 和圖 3-15。

圖 3-15 高脂對小鼠肝臟外觀的影響. KO-HFD，4 周；B. KO-HFD，6 周；C. KO-HFD，8 周；D. KO-ND，4 周；E. KO-ND，6 周；F. KO-ND，8 周Fig3-15 The appearance of liver in every grouup.. KO-HFD，4W；B. KO-HFD，6W；C. KO-HFD，8W；D. KO-ND，4W；E. KO-ND，6W；F. KO-ND，8W3.3.2 高脂對小鼠肝臟組織學變化的影響光鏡下，WT-ND 小鼠肝臟細胞完整，肝索整齊，肝小葉正常。4 周時，KO-ND 小鼠肝胞完整；隨著時間加長，8 周時 KO-ND 小鼠肝臟中出現(xiàn)少量的脂肪空泡，并且肝索間隙變，相比于 WT-ND 小鼠肝細胞排列紊亂。經(jīng)飼喂高脂，WT-HFD 和 KO-HFD 小鼠肝臟有明的脂肪變性、肝細胞膨脹變圓，脂肪變性主要位于中央靜脈周圍。4 周時，WT-HFD 和O-HFD 肝臟脂肪變性達到 1/3，已經(jīng)達到輕度的脂肪變性。隨著飼喂時間加長，WT-HFD KO-HFD 肝臟脂肪變性加重，KO-HFD 小鼠肝臟有炎性細胞浸潤，并有氣泡樣變。結(jié)果見 3-16、圖 3-17。油紅染色后，相比于 WT-ND，KO-ND 小鼠肝臟有少量的脂肪滴紅染；T-HFD 和 KO-HFD 小鼠肝臟有明顯的紅色脂肪滴。結(jié)果見圖 3-18。

圖 3-16 高脂對野生型小鼠肝臟病理學變化的影響A.WT-ND,4 周；B.WT-ND,6 周；C.WT-ND,8 周；D.WT-HFD,4 周；E.WT-HFD,6 周；F.WT-HFD,8 周Fig 3-16 Liver hematoxylin and eosin stain in every group.(HE,10×20)A.WT-ND，4W；B.WT-ND，6W；C.WT-ND，8W；D.WT-HFD，4W；E.WT-HFD，6W；F.WT-HFD，8W

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2808066