間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cell，MSC）具有分化為多種細胞的潛能。這個特性使得MSC在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中成為研究熱點。但是MSC缺乏特定的標(biāo)記，所以對于MSC的生物學(xué)特性，目前了解的還不是很透徹。 在骨髓，肌腱，脂肪以及滑膜等組織都可以分離得到MSC，細胞來源的廣泛性使得MSC成為一種非常有吸引力的治療資源。將MSC應(yīng)用到再生醫(yī)學(xué)的研究，首先就需要將MSC從特定組織得到的細胞混合物中分離出來。大量的研究發(fā)現(xiàn)了MSC表面的一些標(biāo)記，包括CD44，CD73，CD105等，但是這些表面標(biāo)記并不是MSC所特有的。特異標(biāo)記的缺乏在一定程度上限制了MSC的鑒定與分離，因此，目前的研究中，研究者們通常聯(lián)合使用幾個表面標(biāo)記來鑒定MSC，從而克服鑒定困難。再生醫(yī)學(xué)研究中，利用干細胞療法修復(fù)或再生組織的研究已經(jīng)取得了很大的進步。據(jù)報道，MSC可以接種到支架結(jié)構(gòu)或是受一些因子刺激后移植到動物體內(nèi)，可以誘導(dǎo)或促進組織或器官的修復(fù)和再生。 肩袖損傷是一種常見的臨床疾病，由過度使用和年齡老化等原因引起。通過支架材料以及以細胞為基礎(chǔ)的治療肌腱修復(fù)的生物學(xué)方法也正在研究開發(fā)過程中。以骨髓間充質(zhì)干細胞和肌腱干細胞為基礎(chǔ)的修復(fù)和再生肌腱的生物學(xué)療法是目前研究相對較多的。但是由于這兩種細胞分離的有限性，限制了這兩種細胞在肌腱損傷修復(fù)方面的應(yīng)用。因此，我們認(rèn)為與肩袖肌腱連接的肩峰下滑囊組織的細胞可能會是肌腱修復(fù)的種子細胞，更利于肌腱的修復(fù)和再生。 體內(nèi)外實驗評測我們在肩峰下滑囊組織分離得到的細胞的多能性。細胞來源于手術(shù)廢棄物的肩峰下滑囊組織�；谏鲜黾僭O(shè)，在本研究中采集肩袖損傷患者病組織，并將該組織用膠原酶和中性蛋白酶消化為單個細胞懸液，培養(yǎng)及分化結(jié)果證明從該組織分離的細胞具有向成骨、成脂、成軟骨以及肌腱細胞系的潛能。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果也表明該細胞表面含有MSC表面標(biāo)記，細胞是間充質(zhì)干細胞的亞群。體外BMP12處理細胞后，細胞表達肌腱組織相關(guān)的標(biāo)記基因，細胞形態(tài)呈有序的平行狀。用BMP12體外處理細胞并接種到HA/TCP支架結(jié)構(gòu)上，然后移植到小鼠體內(nèi)可以形成范圍較大的骨組織以及肌腱樣組織。通過組織學(xué)分析和DMP1的免疫熒光染色鑒定骨組織的形成，結(jié)果顯示肩峰下滑囊組織的細胞在體內(nèi)形成的肌腱樣組織呈平行的，波浪形的膠原纖維束狀，這是肌腱組織的典型結(jié)構(gòu)特征，而未用BMP12處理的肩峰下滑囊組織間充質(zhì)干細胞在支架結(jié)構(gòu)上形成了成纖維軟骨組織。本研究第一次證明肩峰下滑囊組織來源的細胞在體內(nèi)具有成骨、成纖維軟骨、成肌腱樣組織的潛能，表明該細胞可以在肌腱組織工程的應(yīng)用方面發(fā)揮作用。 骨組織疾病也是極為常見的臨床疾病，其中，骨質(zhì)疏松是最為常見的骨組織疾病。骨組織疾病主要是由于營養(yǎng)不良，癌癥，感染或遺傳以及外界因素造成的，而且?guī)缀跛械墓羌膊〉陌l(fā)病機制都是由于骨吸收與骨形成的不平衡所導(dǎo)致的，發(fā)育階段的骨組織易骨折的狀況也是這個原因引起的。成骨發(fā)育不全是一種遺傳性疾病，在不明原因的情況下經(jīng)常發(fā)生骨折狀況，患有該病的小孩被稱為“玻璃孩”。色素上皮衍生因子（Pigment epithelium-derivedfactor，PEDF）是一種潛在的具有抗血管生成作用的因子，廣泛存在于各種組織。研究表明，PEDF的缺乏是成骨發(fā)育不全癥的一個標(biāo)記，PEDF的突變也會導(dǎo)致成骨發(fā)育不全癥。因此，本研究將探索PEDF在人間充質(zhì)細胞內(nèi)的作用及其作用機制。結(jié)果表明，含有PEDF的細胞維持液培養(yǎng)的細胞表達成骨細胞相關(guān)的基因，在第14天，該培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞表現(xiàn)出ALP活性；另外，在含有PEDF的成骨誘導(dǎo)液內(nèi)培養(yǎng)的細胞的ALP活性相對于只有成骨分化液誘導(dǎo)的細胞組提高了19%（35.655±1.827U/mg蛋白, P=0.0.041VS29.956±2.100U/μg protein）。通過茜素紅定量研究發(fā)現(xiàn)，含有PEDF的成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)的細胞形成的鈣沉積水平比單獨的成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)的細胞組高50%以上（2.108±0.306OD/ml/well/1x104cells/cm2，P=0.017VS1.398±0.098OD/ml/well/1x104cells/cm2）。PEDF特異的siRNA抑制MSC的PEDF表達水平后，ALP活性也下降（PEDFsiRNA組:33.552±2.009U/ng蛋白VS對照siRNA組39.269±3.533U/ng蛋白, P=0.039），同時鈣沉積水平也顯著降低（PEDF siRNA組：0.654±0.050OD/ml/per well/1x104cells/cm2VS對照組：1.152±0.132OD/ml/well/1x104cells/cm2, P=0.010），外源的PEDF蛋白可以部分恢復(fù)ALP活性和鈣沉積水平。在人的MSC細胞內(nèi)，PEDF通過激活ERK和AKT信號通路誘導(dǎo)成骨分化相關(guān)基因的表達。這些數(shù)據(jù)表明，PEDF參與人MSC的成骨分化過程，主要影響細胞的鈣沉積水平。 綜上所述，人類肩峰下滑囊間充質(zhì)干細胞（HBDMSC）在以MSC為基礎(chǔ)的治療肌腱損傷相關(guān)疾病方面具有巨大的潛能，是促進肌腱修復(fù)和再生的種子細胞。在人的MSC中，PEDF通過ERK和AKT信號通路調(diào)控成骨細胞分化進程，尤其是鈣沉積水平。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

圖 1-1 間充質(zhì)干細胞的分化潛能Figure 1-1 The potential differentiation of Mesenchymal Stem Cells.1.3.3.1 骨髓間充質(zhì)干細胞骨髓間充質(zhì)干細胞在再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用方面，是應(yīng)用最廣泛的一種細胞。骨 基 質(zhì) 以 及 造 血 系 統(tǒng) 形 成 了 骨 髓 這 樣 的 一 個 結(jié) 構(gòu) （ 圖 1-2 ，tp://stemcells.nih.gov/info/2001report/pages/chapter5.aspx）。骨髓基質(zhì)含有的細胞類型包括，成骨細胞，破骨細胞，成纖維細胞，巨噬胞，脂肪細胞以及內(nèi)皮細胞。而在造血系統(tǒng)中主要含有的組織就是髓體，在血生成中發(fā)揮作用。顯而易見，這兩部分是不同的；但是不能割分他們之間互影響，相互作用的關(guān)系。骨髓基質(zhì)間接參與血細胞生成，在這過程中他的用是在分化為血細胞的過程中提供機械支持的作用，同時表達一些細胞的信[29]

造血干細胞（HSCs）也是在骨髓中分離得到的。是自上世紀(jì) 50 年代開始研究最廣泛，也是特征最透徹的成體干細胞。這些未分化的細胞具有干細胞的自我更新能力以及多能性的特性。另外，這些細胞還可以按照有序的規(guī)律進行遷移并通過凋亡的方式被調(diào)控。HSCs 是可以分化為所有類型的血細胞包括粒細胞的血細胞，如單核細胞，巨噬細胞，中性粒細胞，嗜堿性粒細胞，嗜酸性粒細胞，紅細胞，血小板，和樹突狀細胞，以及淋巴譜系的 T 細胞，B 細胞，NK細胞（參見圖 1-2，http://stemcells.nih.gov/info/2001report/pages/chapter5.aspx）[30]。HSCs 也能分化為間充質(zhì)組織的細胞包括肌肉和腦細胞。HSCs 表達 CD14，CD31，CD38，CD45 和 CD133。而在骨髓中分離到的其它的成體干細胞也會表達其中的一些表面標(biāo)識。幾十年來，通過手術(shù)移植的方法將 HSCs 用于癌癥，再生障礙性貧血，地中海貧血，鐮刀狀細胞貧血癥，成骨不全癥，自身免疫性疾病等疾病的治療。

[49]。該圖是一個干細胞正在分裂的過程。干細胞可以分裂為子代干細胞也可以分裂為特化的祖細胞。這些祖細胞具有一些干細胞的分裂以及分化的能力，但是這些特征不像干細胞那么強。他們最終都會成為特化的細胞[49]。與 ESC 相比，大多數(shù)的 MSC 只能在有限的復(fù)制代數(shù)中保持它的干性。MSC 的增殖效率在某種程度上比大多數(shù)細胞高，但是最終也不會逃脫衰老的命運。只有一小部分細胞在培養(yǎng)過程中可以具有長期的自我更新的能力[50,51]�！霸谌祟愐约靶∈蟮母杉毎�，干細胞的自我更新能力會隨著年齡的增長，尤其是在受到壓力的狀況下而減弱”[52]。在成體組織中分離到處于靜態(tài)的 MSC 通常都很少[53]。這些細胞大多數(shù)都不是明顯的處于 G0 期，而是在向 G1 期緩慢的前進[52]。例如，F(xiàn)riedstein 實驗室研究結(jié)果顯示在 105的骨髓間充質(zhì)干細胞中只有一個細胞具有形成于骨髓基質(zhì)相關(guān)的祖細胞的克隆[21,54,55]。在脂肪組織中，每 105個細胞，有一個是潛在的 MSC。而這個問題可以通過增大組織的基數(shù)以及體外培養(yǎng)擴增細胞得到解決。

【共引文獻】

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本文編號：2807704