【摘要】：目的：研究人RANKL-TNF樣區(qū)多肽疫苗能否刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體，并檢測(cè)該抗體拮抗腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）的致炎和核因子-κB受體活化因子配體（Receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)的致骨破壞效果，并評(píng)價(jià)疫苗對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（Collagen inducedarthritis，CIA）小鼠的保護(hù)作用。 方法：選取人RANKL-TNF樣區(qū)與人TNF-α高度相似區(qū)域?yàn)橐呙绾蜻x表位，非相似區(qū)域用Th2細(xì)胞表位取代，重組PCR法拼接上述基因片段，構(gòu)建pET-28a-RTFP-2原核表達(dá)載體；經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白并鑒定，大量提取，純化，去除內(nèi)毒素（多肽疫苗命名為RTFP-2）；于0d，14d和28d應(yīng)用100μg該疫苗免疫BALB/c雌性小鼠，間斷收集血清，間接ELISA法檢測(cè)血清中產(chǎn)生的雙靶向抗體識(shí)別結(jié)合RANKL和TNF-α的能力，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)抗體滴度變化及持續(xù)時(shí)間；二次加強(qiáng)免疫后10d，腹腔注射人TNF-α使小鼠產(chǎn)生惡液質(zhì)，監(jiān)測(cè)死亡率和體重下降率；靜脈注射人RANKL使小鼠血鈣升高和破骨細(xì)胞活化，監(jiān)測(cè)血鈣升高水平，一周后處死，抗酒石酸酸性磷酸酶染色計(jì)數(shù)各組小鼠脛骨的破骨細(xì)胞數(shù)目；二次加強(qiáng)免疫后1周，各組DBA/1小鼠間隔三周尾根部皮內(nèi)免疫100μg牛Ⅱ型膠原，制備CIA小鼠，監(jiān)測(cè)各組小鼠發(fā)病率，記錄關(guān)節(jié)評(píng)分至二次免疫后50d，處死小鼠，四肢骨行組織學(xué)和Micro-CT檢測(cè)，分析炎癥浸潤(rùn)和骨破壞程度，ELISA法檢測(cè)血清中RANKL和TNF-α的變化。 結(jié)果：RTFP-2多肽疫苗在pET-28a原核體系中表達(dá)良好，經(jīng)檢測(cè)為包涵體表達(dá)，RANKL和TNF-α抗體可識(shí)別純化后的多肽疫苗；與佐劑對(duì)照組小鼠相比，疫苗免疫的小鼠可產(chǎn)生高滴度的抗體，停止免疫后抗體滴度可持續(xù)約2個(gè)月，再次加強(qiáng)免疫后抗體滴度可在短期內(nèi)達(dá)到峰值；疫苗免疫的小鼠產(chǎn)生的抗血清可拮抗TNF-α和RANKL的生物學(xué)活性，使TNF-α所致的L929細(xì)胞的凋亡率下降50%，使RANKL所致的破骨細(xì)胞的分化成熟受阻；疫苗免疫后的小鼠，惡液質(zhì)癥狀減輕，體重下降減緩，死亡率下降28%，血鈣水平升高延緩，小鼠股骨的破骨細(xì)胞數(shù)量維持在正常水平；疫苗免疫的小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病率下降，反應(yīng)疾病嚴(yán)重程度的關(guān)節(jié)評(píng)分降低，與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠相比，組織學(xué)評(píng)估顯示疫苗組小鼠關(guān)節(jié)面光滑，關(guān)節(jié)腔中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，軟骨面完整，厚度正常，骨髓腔中未見(jiàn)炎性細(xì)胞，影像學(xué)Micro-CT掃描顯示疫苗組小鼠的關(guān)節(jié)軟骨和骨結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，骨破壞程度明顯減輕，血清學(xué)檢測(cè)顯示疫苗組小鼠血清中RANKL和TNF-α的分泌水平也相應(yīng)下降。 結(jié)論：人RANKL-TNF樣區(qū)多肽疫苗可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，該抗體可有效中和TNF-α和RANKL的生物學(xué)活性，減輕惡液質(zhì)和高鈣血癥小鼠的癥狀，降低CIA小鼠的發(fā)病率和疾病嚴(yán)重程度，為炎癥性骨病的治療提供了新的思路和方向。
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【圖文】：

圖 1. RA 炎癥與骨破壞的免疫病理學(xué)改變 量 的 研 究 證 實(shí) ， 腫 瘤 壞 死 因 子 超 家 族 （ Tumor necrosmily，TNFSF）成員腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor α, TN 在 RA 炎癥和骨破壞的病理改變中發(fā)揮不可或缺的作用（見(jiàn)

圖 2. TNF-α 和 RANKL 致炎與介導(dǎo)骨破壞的交叉通路NKL 和 TNF-α 同為 TNFSF 成員，RANKL 胞外區(qū)的 157 個(gè)氨 樣區(qū)，其氨基酸序列和蛋白空間結(jié)構(gòu)都存在與 TNF-α 相似的

圖 1. 人 RANKL 和 TNF-α 的序列一級(jí)結(jié)構(gòu)一致性分析re 1. Amino acid sequence alignment in human RANKL and Telected domains are underlined.

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 董偉;戚孟春;鄧久鵬;陳洪偉;馮曉潔;廖囡囡;;阿侖膦酸鹽對(duì)成骨細(xì)胞相關(guān)基因RANKL、OPG表達(dá)的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2012年12期

2 李盛村;鮑捷;王國(guó)祥;;IL-6與OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2013年05期

3 高貝;申曉靖;武蕾;;RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)及靶點(diǎn)治療的研究進(jìn)展[J];中國(guó)衛(wèi)生產(chǎn)業(yè);2012年15期

本文編號(hào)：2802869