【摘要】：第一部分不同T淋巴細胞中人HMGB1mRNA和蛋白的表達水平 目的：觀察HTLV-1+、Tax+和Tax-T淋巴細胞人HMGB1mRNA和蛋白的表達水平，分析Tax蛋白是否影響HMGB1的表達。 方法：從Tax-T細胞（Jurkat和TaxN）、Tax+T細胞（TaxP）、HTLV-1+T細胞（MT-4、MT-2）提取總RNA和蛋白質(zhì)，以及瞬時轉(zhuǎn)染pCMV-Tax表達載體及其突變型Tax M22、Tax M47至Jurkat細胞，24h后提取總RNA和蛋白質(zhì)。然后通過逆轉(zhuǎn)錄實時PCR定量檢測HMGB1mRNA表達水平，分析Tax蛋白對HMGB1mRNA表達的影響；通過免疫印跡檢測HMGB1蛋白表達水平，分析Tax及其突變蛋白對HMGB1蛋白表達的影響。 結(jié)果：Tax+T細胞（TaxP）中HMGB1mRNA和蛋白質(zhì)表達水平明顯高于Tax-T細胞（Jurkat、TaxN）。HTLV-1+T細胞（MT-2、MT-4）中的HMGB1mRNA表達水平略微低于HTLV-1-T細胞（TaxP、Jurkat），而HTLV-1-T細胞（Jurkat）和HTLV-1+T細胞（MT-2、MT-4）間HMGB1蛋白未表現(xiàn)出明顯的差異。瞬時轉(zhuǎn)染Tax及其突變型M22和M47至Jurkat細胞中，Tax及其M22、M47突變蛋白促進HMGB1mRNA和蛋白的表達。 結(jié)論：HTLV-1病毒Tax蛋白可能與某種轉(zhuǎn)錄因子相互作用促進人HMGB1基因的表達，而HTLV-1病毒的其他蛋白可能抑制HMGB1基因表達。了解不同T淋巴細胞中HMGB1基因表達情況，為進一步研究Tax蛋白如何影響人HMGB1基因調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。 第二部分不同HMGB1熒光素酶報告基因及其Jurkat穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建 目的：構(gòu)建不同高遷移率族蛋白B1（HMGB1）調(diào)控序列的熒光素酶報告基因及其穩(wěn)定表達的Jurkat細胞株，為研究Tax蛋白影響HMGB1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供質(zhì)粒及細胞來源。 方法：設計多個3’-端固定的HMGB1調(diào)控引物，以Jurkat細胞基因組DNA為模板，PCR擴增不同長度HMGB1調(diào)控基因（-83~+83、-383~+83、-688~+83、-975~+83、-1163~+83、-1327~+83、-1520~+83），均將其連入pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化宿主菌DH5a，氨芐青霉素篩選，陽性克隆并提取質(zhì)粒，經(jīng)KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定和DNA測序驗證，正確的陽性克隆經(jīng)KpnⅠ/HindⅢ雙酶切后，連入pGL3-neo-luc報告基因的KpnⅠ/HindⅢ位點之間，成功構(gòu)建含不同HMGB1調(diào)控基因的熒光素酶報告基因pGL3-HMGB1-luc質(zhì)粒。同樣，-1520~+83HMGB1調(diào)控基因經(jīng)XhoⅠ/HindⅢ雙酶切后，連入pGL3-neo-luc報告基因的XhoⅠ/HindⅢ位點之間，又構(gòu)建出含-504~+83HMGB1的pGL3-HMGB1-luc質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染不同pGL3-HMGB1-luc和pGL3-neo-luc報告基因質(zhì)粒至Jurkat細胞，48h后加入終濃度600μg/ml的G418進行藥物加壓篩選20d，然后選取單個陽性克隆細胞，用300μg/ml繼續(xù)篩選2～3個月，熒光素酶活性驗證是否成功構(gòu)建其穩(wěn)定表達的Jurkat細胞株。 結(jié)果：以Jurkat細胞基因組為模板，克隆擴增7個3’-端固定的HMGB1調(diào)控基因，成功構(gòu)建了8種pGL3-HMGB1-luc報告基因，按HMGB1基因由短至長順序依次命名為pHLuc1～pHLuc8。轉(zhuǎn)染pHLuc1～pHLuc8報告基因和pGL3-neo-luc至Jurkat細胞，經(jīng)G418藥物篩選，成功構(gòu)建含有pHLuc1～pHLuc8或pGL3-neo-luc報告基因的Jurkat穩(wěn)定細胞株，并根據(jù)HMGB1調(diào)控基因有無及其由短至長順序，依次命名為HJ1～HJ8細胞和NEO細胞。 結(jié)論：成功構(gòu)建HMGB1熒光素酶報告基因及其HJ穩(wěn)定細胞株，為找尋HMGB1啟動子區(qū)域，研究Tax蛋白影響HMGB1基因的調(diào)控機制和HMGB1在成人T淋巴細胞白血病中的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。 第三部分HTLV-1病毒Tax蛋白對人T淋巴細胞HMGB1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響 目的：觀察不同T淋巴細胞中人HMGB1基因啟動子活性，探討Tax及其M22、M47突變蛋白對HMGB1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。 方法：不同pGL3-HMGB1-luc報告基因和pGL3-neo-luc（對照）同時瞬時轉(zhuǎn)染到THP1、Hela、Jurkat、TaxP、TaxN、MT-4、MT-2等不同種類細胞中，以及不同pGL3-HMGB1-luc報告基因與pCMV-Tax或其突變型M22、M47（pCMV-Neo作為對照）瞬時共轉(zhuǎn)染到Jurkat細胞中，24h后檢測熒光素酶活性，觀察不同細胞中相對熒光素酶活性比率（HMGB1/neo）和Tax及其M22、M47突變蛋白對T淋巴細胞中HMGB1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控情況（Tax/Neo）。Tax及其突變型Tax M22、Tax M47瞬時轉(zhuǎn)染到HJ穩(wěn)定細胞株（HJ1~HJ8），pCMV-Neo質(zhì)粒作為對照，比較不同HJ細胞株中HMGB1的相對熒光素酶活性（Tax/Neo）。通過細胞接觸逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法，HTLV-1+的MT-2細胞（Hut-78細胞作為對照）分別與HJ穩(wěn)定細胞株（HJ1~HJ8）以1:4的比例進行共培養(yǎng)，比較每種細胞株中HMGB1的相對熒光素酶活性［（MT-2）/（Hut-78）］。比較Tax蛋白對瞬時表達HMGB1基因和穩(wěn)定表達HMGB1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控差異。觀察BAY11-7082/NF-κB抑制劑對Tax蛋白誘導HMGB1基因轉(zhuǎn)錄的影響。 結(jié)果：HMGB1在不同種類細胞中的調(diào)控趨勢大致相似，均表現(xiàn)出587bp長度HMGB1（-504~+83）的啟動子活性最高。HTLV-1+T細胞（MT-4、MT-2）中HMGB1的轉(zhuǎn)錄活性略低于HTLV-1-T細胞（Jurkat、TaxP）。比較TaxN（Tax-）和TaxP（Tax+）細胞中HMGB1的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)現(xiàn)，Tax蛋白促進pHLuc6～pHLuc8質(zhì)粒中HMGB1基因的轉(zhuǎn)錄。不同pGL3-HMGB1-luc報告基因與pCMV-Tax共轉(zhuǎn)染到Jurkat細胞也顯示，Tax蛋白對-975~+83HMGB1基因影響不明顯，但促進pHLuc6～pHLuc8報告基因中HMGB1的轉(zhuǎn)錄表達。隨著Tax劑量的增加，pHLuc6質(zhì)粒中HMGB1的轉(zhuǎn)錄活性明顯增強。Tax及其突變型Tax M22、Tax M47與pHLuc3或pHLuc6共轉(zhuǎn)染至Jurkat細胞發(fā)現(xiàn)，Tax及其M22、M47突變蛋白對pHLuc3質(zhì)粒中HMGB1轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響不明顯，而促進pHLuc6質(zhì)粒中HMGB1基因的轉(zhuǎn)錄。BAY11-7082/NF-κB抑制劑不影響Tax蛋白調(diào)控HMGB1基因的轉(zhuǎn)錄。 結(jié)論：-504~-383可能是HMGB1轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵啟動子區(qū)，Tax蛋白可能結(jié)合在HMGB1的-1163~-975區(qū)段誘導其轉(zhuǎn)錄，但不是通過NF-κB途徑進行的。 第四部分富集Tax蛋白的HMGB1基因生物信息學分析及Tax蛋白對其基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的研究 目的：探討Tax蛋白影響人T淋巴細胞HMGB1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因片段、順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子。 方法：TaxP細胞經(jīng)固定、超聲和染色體免疫共沉淀（ChIP）處理后獲得純化的DNA，通過特異性引物，實時定量PCR擴增中心位點于-1103和-797處的HMGB1基因，尋找Tax蛋白富集在HMGB1的基因部位。應用生物信息學初步分析HMGB1-1163~-975區(qū)段的反式作用因子結(jié)合位點，通過野生型pHLuc6分別對其順式作用元件實施缺失突變，構(gòu)建不同突變型pHLuc6報告基因。在Jurkat中瞬時共轉(zhuǎn)染pCMV-Tax和突變型pHLuc6（野生型pHLuc6作為對照），或pCMV-Tax（pCMV-Neo作為對照）和突變型pHLuc6，24h后檢測熒光素酶活性，比較Tax蛋白對野生型和突變型pHLuc6中HMGB1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控差異，尋找Tax蛋白影響人T淋巴細胞HMGB1基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。 結(jié)果：ChIP純化后的樣本經(jīng)實時定量PCR擴增后，我們發(fā)現(xiàn)Tax蛋白在HMGB1-1103基因（-1163～-1043）的富集信號明顯強于-797基因（-848～-746）的信號。即Tax蛋白主要富集在HMGB1的-1163~-975區(qū)段。生物信息學分析獲知，HMGB1-1163~-975區(qū)段有6種反式作用因子（AML-1a、AP-1、CdxA、USF、v-Myb和C/EBP）。使用野生型pHLuc6，分別針對每種轉(zhuǎn)錄因子的順式作用元件進行缺失突變，重新成功構(gòu)建分別針對上述6種轉(zhuǎn)錄因子的突變型pHLuc6，依次命名為mLuc6-AM、mLuc6-AP、mLuc6-Cd、mLuc6-U、mLuc6-M、mLuc6-C。瞬時共轉(zhuǎn)染pCMV-Tax和野生型pHLuc6或其突變型pHLuc6至Jurkat細胞后，發(fā)現(xiàn)突變型mLuc6-C中HMGB1的轉(zhuǎn)錄活性低至野生型pHLuc6的52％，并且在Jurkat細胞中Tax蛋白不影響mLuc6-C中HMGB1基因的調(diào)控表達。 結(jié)論：Tax蛋白富集在HMGB1的-1163~-975區(qū)段，可能通過轉(zhuǎn)錄因子C/EBP調(diào)控HMGB1基因的轉(zhuǎn)錄表達。了解Tax蛋白影響HMGB1基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機制，為ATL的臨床治療提供了一個新途徑。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3411

【參考文獻】

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本文編號：2800292