【摘要】： 干細胞因子(stem cell factor，SCF)，是原癌基因c-kit的配體，是作用在造血過程中較早期的造血因子，其基因定位于人第12號染色體q~(22～24)區(qū)。SCF在體內有兩種存在方式：膜結合型和可溶性，可溶性人SCF分子，由胞外區(qū)1～164個氨基酸組成，在體內有時通過非共價鍵形成二聚體存在，是一種多功能細胞因子，作用于多譜系造血細胞。自1990年SCF被發(fā)現(xiàn)以來，其功能也不斷被發(fā)現(xiàn)，并被闡述清楚。SCF能夠協(xié)同其他的細胞因子，如EPO、GM-CSF、G-CSF、IL-2、IL-3、IL-11和TPO等，SCF都有明顯的協(xié)同效應。臨床上應用SCF治療貧血、提高放、化療后白細胞數(shù)量、體外造血、基因治療等，是一種前景看好的細胞因子藥物。已經證實，在E.coli中表達的未糖基化的可溶性人SCF，與天然的可溶性人SCF具有同樣的生物學效應。 重組人干細胞因子在E.coli中較難實現(xiàn)高表達，從1992年開始研究hSCF在E.coli中的表達，為了獲得高效表達，我們曾經嘗試過許多方法，雖然都沒有達到滿意的效果，但是積累了許多經驗。本研究以pBV-220溫度敏感表達載體為模板，借助計算機分析軟件分析原來工作獲得的結果，尋找影響rhSCF在E.coli中高效表達的因素。pBV-220表達載體，是國內科學家自己構建的原核高效表達載體，目前在國內被廣泛應用于生產基因重組藥物。普遍認為影響外源基因在該載體中表達效率主要有三個因素：SD序列長度、基因起始碼ATG和終止碼TAA處RNA二級結構和密碼子偏性。通過分析認為：SD序列長度在hSCF的表達中不起關鍵性作用，SD序列長度的改變不能提高起表達效率；天然hSCF兩端的RNA二級結構基本符合高表達判別函數(shù)，試驗中沒有得到高效表達，通常有目的的改造外源基因與載體連接處的RNA二級結構，就能夠獲得高效表達，修改hSCF兩端的RNA二級結構后，也沒有實現(xiàn)高表達，提示可能還有另外的原因存在。我們認為是由于密碼子偏性影響了hSCF基因在E.coli中的高效表達�？扇苄詇SCF蛋白由164個氨基酸組成，其中有57個氨基酸的密碼子表達系數(shù)低于0.1，占總氨基酸數(shù)量的34.8％。由于編碼hSCF基因中的密碼子不是E.coli所偏愛，并且低表達指數(shù)的氨基酸成組存在，造成該基因在E.coli中較難實現(xiàn)高 ＿第。軍醫(yī)大學博十學位論義”小義仰業(yè)g g 【 效表達。Z 找到影響hSCF基因在E。。h中高效表達的因素之后，嘗試通過對hSCF ｛ 基因進行改造，以實現(xiàn)hSCF在大腸稈菌中的高效表達。對hSCF的基因進行了1 改造，修改編碼hSCF氨基酸的部分密碼子，使編碼hSCF中每個氨基酸的表達8 ＿指數(shù)不低于0＊。分段合成改造后的基因，PCR一次性充成全基因的拼接，將叢Z －g 因克隆到叼爪220載體上。測序結果顯示插入的基因序列與原設計一致，誘導g 表達后山沈F占菌體總蛋白的2＊％，與基因改造前10％的表達效率利I比，竹了￥ 近2倍的提高。Western七＊ 鑒定，表達的蛋白能夠為hSCF的單克隆抗體所識f ＿別。小量發(fā)酵，初步純化的rhSCF蛋白，純度大于80％，能夠促進Mo7e細胞。 －的增殖活性�！� 1998年至今，紅細胞分化相關的研究，不斷取得進展，紅細胞分化機制正g 在被逐漸闡述清楚。SCF及其配體仁七it在紅系分化中，不僅僅是協(xié)同紅細胞生j 成素＊rythrpoietin，EPO人而且參與其中，并且起著重要作用。新近的研究發(fā) ＿現(xiàn)，S＊F和＊PO一樣，在紅系分化中起非常重要作用，它能夠抑制紅系造血扭 ＿細胞的凋亡，促進紅系干、祖細胞增殖和分化，而且是紅系祖細胞增州、分化 －＿的必要條件。但是S＊F對非正常發(fā)育的細胞，是否也同樣具有抑凋亡、促增則 的作用呢？在8＊＊L大鼠白血病造血葉。，＊＊F具有兩利嚇同的生物效應，山］既 能有效地刺激正常造血，又可抑制白血病細胞增殖。那么在人體中SCF足否也 ＿－具有這樣兩種不同的生物效應呢？ 一、以紅白血病細胞系一K562細胞為研究模板，嘗試探討 SCF小kit在紅系“l(fā)“／ 祖細胞增殖分化上的作用。已經有大量文獻報道，hEpO、HCmill和 RA能夠誘 －導K562細胞向紅系分化。經過誘導后的K562細胞，血紅蛋白表達增加，紅系 ＿相關的轉錄因子激活，具有了紅系祖細胞一些特征。本研究用rhEPO、Flemin ＿和RA分別誘導K562細胞向紅系分化，檢?
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2002
【分類號】：Q78
【圖文】：

再將預測結果與生物學實驗檢驗現(xiàn)了預測結果與實驗結果不一致的現(xiàn)KL7和KL4兩個克隆的3’端結構松，表達時部分RNA會有降解，因此難現(xiàn)高效表達，說明影響hSCF基因高lG3Keal/mo!LESCHESC一11.2一11.2一】2.311.1783】1.503414.503413.325013.055915.55463RNA二級結構與表達效率分析etweenseconda口struetureofPri一nerand

3.6基因克隆經過計算機分析，我們認為利用PCR可以一次性完成全叢囚拼接。按圖3方案進行:將18條寡核首酸片段各取10Pg棍合作為模板，PCR擴一增(擴一增條們幾:94℃lmin，65oC305，72℃305)，回收soobp片段(圖3)，從EcoRI不11Ba，nHI定向插入到PBV一220載體。2000bP1000bP750bP500bP250bP100bP一琪一一一圖3基因拼接F19.3eonneetionofreeo一nbinantgeneofSCF3.7序列測定本試驗設計是將hSCF基因直接克隆到pBv一220載體中，!人}此不能象共他克隆載體一樣

和BamHI位點之間插入的基因與原設計一致(3.8誘導表達研究同時從平板上挑取基因改造前接種于3ml含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，30℃液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)2h，溫搖床中振蕩培養(yǎng)6h。S000rlminsmin離心收集圖5):薄層掃描顯示進行基因改造后，SCF表得最大的表達效率，還嘗試了在不同宿主菌PBV一SCF重組質粒，分別轉化3種不同遺傳背轉化了同一質粒的不同細菌同時誘導，SDS一隊G基因在DHSQ細菌中獲得了最高的目的蛋白/菌終的表達菌。

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 李伍舉,吳加金;pBV220載體中外源基因表達水平定量分析[J];病毒學報;1997年02期

2 胡守旺,梁希若,吳淑華;突變和修飾IFN-α2b基因的5’和3’端對其在E.coli表達的調控作用[J];免疫學雜志;2000年05期

3 賴春寧,朱元曉,沈倍奮,洪海燕;人SCF非融合蛋白的純化及生物活性[J];生物化學與生物物理進展;1999年01期

4 薛生,孫瑛勛,朱元曉,沈倍奮;鼠抗人重組SCF—McAb細胞系的建立[J];中國免疫學雜志;1993年05期

本文編號：2800202