【摘要】：研究背景各種原因引起機體的組織缺損、深層組織(如筋膜、肌肉、骨、血管或神經(jīng)等)外露,包括創(chuàng)傷、腫瘤切除術后、糖尿病潰瘍、壞疽、褥瘡,以及先天性畸形等,都需要進行修復。臨床上最常用的修復方法是：基于機體自身某局部的一穿支血管,切取以該血管血供為基礎的皮膚或復合組織作為供體,對缺損部位進行修復、重建,阻止深層組織繼續(xù)外露。此類自體移植、用于修復缺損的“以某穿支血管為基礎的皮膚組織塊”,即可稱為穿支皮瓣(Perforator Flap)。穿支皮瓣是最近幾十年伴隨顯微設備發(fā)展起來的、用于修復組織缺損的一項新技術,它是在傳統(tǒng)的肌皮瓣術式基礎之上,僅選擇性切取供養(yǎng)皮瓣的穿支血管,并以該穿支血管作為血管蒂進行移植修復,保留了供區(qū)的主要血管,且無須攜帶肌肉組織,從而大大地減少了對供區(qū)的繼發(fā)性損傷,因而得以廣泛地應用于臨床。然而,單純的穿支皮瓣僅以管徑細小的皮膚穿動脈為蒂進行取瓣,穿支血管并非主干,故其供皮面積偏小。在一些較大的組織缺損(如燒傷、交通傷等,損傷面積較大且損傷嚴重),其損傷面積常大大地超過單個軸型血管穿支皮瓣所能覆蓋的范圍,這便給臨床修復重建帶來了極大的困難,為適應這種大面積修復的需要,臨床上也隨之出現(xiàn)了基于兩個或兩個以上穿支血管的大皮瓣或超大皮(組織)瓣,因此,如何對其進行擴大切取便成了皮瓣外科的一個重要課題。對于這些超大型的聯(lián)合皮(組織)瓣而言,其血液供應的穩(wěn)定性、穿支血管體之間微血管的有效吻合情況等,是決定其成活率的關鍵因素。早在1987年,Taylor等應用血管造影技術對人體及其一些哺乳動物的皮動脈進行了細致入微的研究,統(tǒng)計出人體平均有口徑≥0.5mm的皮膚穿支血管374支,可切取近40個穿支血管皮瓣。并根據(jù)皮膚內(nèi)血管由深向淺呈立體三維分布的特點與規(guī)律,提出了“Vascular Territories"(血管體,angiosome)的概念,他們認為,每一支知名的皮膚血管的供區(qū)都不僅僅局限于其分布范圍內(nèi)的皮膚及皮下組織,而是一個包含有同一區(qū)域內(nèi)相應的肌肉、肌腱、骨骼等多種組織在內(nèi)的三維組織塊,稱之為“血管體”(angiosomes),全身體表共可劃分為40多個這樣的“血管體區(qū)”,兩“血管體”之間則借微血管吻合(即choke vesse ls)互相連接。血管體(或稱之為血管分布區(qū)域)新這個概念的提出,不但促進了多種皮瓣新供區(qū)的發(fā)現(xiàn)、新術式的產(chǎn)生,而且也促進了對傳統(tǒng)皮瓣移植方式的改進。差不多同一時期,Cormack等通過分析相鄰血管體之間的關系,將皮膚的血管供區(qū)依次分為三個層次：解剖學供區(qū),血流動力學供區(qū)以及潛在供區(qū)。即：1.某一源動脈呈樹形分布的立體區(qū)域,其所到之處為解剖學供區(qū)(anatomical territory),'除與Taylor等提出的“血管體區(qū)”相當,是最基本的血管供區(qū)。2.每一個解剖學供區(qū)與其周圍相鄰動脈之間均有豐富的吻合。當一側血管被切斷或阻斷時,則其下游血管內(nèi)的血壓下降。此時,解剖學供區(qū)血管內(nèi)的血流就會跨越原來的吻合部位(choke vessels)向其體區(qū)進行供血。這種緊鄰解剖學供區(qū)的擴張部分被稱之為血流動力學供區(qū)((lynamic territory)。3.在跨越動力學供區(qū)的基礎上,若再繼續(xù)向遠鄰的供區(qū)延伸,則稱其為潛力供區(qū)(potential territory)。這表明：有可能將皮瓣從解剖學供區(qū)向緊鄰的動力學供區(qū)擴張,得到較大的皮瓣,若再繼續(xù)向遠鄰的潛力供區(qū)延伸,則可得到更大的皮瓣。但是,能否成功擴大切取的前提是必須知道：不同供區(qū)之間是否存在有效的吻合血管(即choke vessels),能夠建立起“新的血液循環(huán)體系”將三個不同的小供區(qū)變成一個大供區(qū)。因此,各供區(qū)間血管網(wǎng)的形態(tài)學特征,其血流動力學特征,以及如何加強體區(qū)間血管的有效溝通便成了皮瓣外科最大、最重要也是最難的課題。既往對于穿支體間微血管吻合的研究,多在于尸體層面進行的大體灌注,由于尸體的“非生理性”,對其小血管的研究勢必不能反映活體的生理狀態(tài)；再則,由于灌注劑的類型、粘稠度、灌注壓力等因素的限制,僅灌注效果就未必能取得良好狀態(tài)。本課題選取SD大鼠為實驗對象,制作皮瓣模型,通過安裝自行設計、改良的皮膚觀察窗,在直視下進行實時觀察,對組織進行分子水平表達物質的測定,總結血管體間吻合的擴增規(guī)律。在此基礎上,選擇不同時間段進行灌注、標記微血管,以期能重建、還原微血管吻合的空間結構。目的1.對實驗組前期設計的皮膚觀察窗進行改良,以期重新設計并制作出更符合本實驗需求的皮膚觀察窗；采用大鼠皮膚觀察窗,直視下觀察體區(qū)間微血管吻合(且choke vessels)在不同時間點的擴增情況及吻合變化,并初步得出其變化規(guī)律：2.采用大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells of rat, MSCs-rat)和血管內(nèi)皮細胞因子(vascular endothelial growth factor of rat, VEGF-rat)這兩種干預方法,觀察它們對于choke vessels擴增過程的影響；3.獲取組織進行Rt-PCR、免疫組化等檢測,確定分子表達物變化規(guī)律；4.利用明膠-氧化鉛對大鼠全身動脈進行灌注,取皮行X攝片,計算、比對不同組的各時間點微血管吻合處的微血管密度(灰度值)；5.結合Evans Blue對血管內(nèi)皮標記,初步探討激光共聚焦顯微鏡在大鼠皮膚血管三維重建中的應用價值,以期研究大鼠皮膚相鄰血管體之間choke vessels形態(tài)學特征,并探索出精度更高而又簡便實用的血管3D可視化新技術。方法第一部分,是本課題前期實驗部分：取成年SD大鼠6只,通過氧化鉛-明膠造影初步了解大鼠背部主要穿支體的分布；取成年SD大鼠6只,安裝皮膚觀察窗后(不切取皮瓣、不離斷穿支蒂),通過錄像初步了解大鼠皮膚穿支動、靜脈伴行情況；另外,選取體重為70±10g的幼齡SD大鼠12只,自行提取、培養(yǎng)MSCs,檢測其純度合格后凍存在-80℃的冰箱中,以滿足后期實驗的需要；第二部分、第三部分是本課題主體實驗部分。第二部分：選取SD大鼠為實驗對象,通過制作SD大鼠皮瓣模型(即：使得相鄰兩個穿支血管的體區(qū)互為動力學供區(qū)),在背部皮膚上安裝自行設計、改良的皮膚觀察窗,隨機編號分三組,分別為單純皮窗組、MSCs干預組(皮窗+MSCs組)和VEGF干預組(皮窗+VEGF組)：1.體視顯微鏡觀察部分：取18只SD大鼠,隨機編號分三組。(1)單純皮窗組通過安裝皮膚觀察窗,在體視顯微鏡下對大鼠背部皮膚血管體間的微血管吻合(choke vessels)處的管徑、密度變化情況,以及微血管吻合處的延時擴增情況進行長時間的活體實時觀察；(2)MSCs干預組和VEGF干預組,分別加入MSCs和VEGF這兩個干預因素,再通過觀察窗,在體視顯微鏡下對大鼠背部皮膚血管體間的微血管吻合處的管徑、密度變化情況,以及微血管吻合處的延時擴增情況進行長時間的活體實時觀察,并探索常見的血管生成相關的分子因素對微血管吻合擴增的影響；2.實驗室檢測部分：取72只SD大鼠,隨機編號分三組：在各組大鼠背部觀察區(qū)皮膚上,按照不同時間點進行取材,行HE染色、Rt-PCR、免疫組化等檢查,檢測毛細血管表達水平和分子表達物的表達水平(VEGF-mRNA),并運用統(tǒng)計學軟件在不同時間點及不同組別間作比對,總結血管體之間的微血管吻合的變化規(guī)律,探究其受影響的因素；第三部分,不分組、不安裝皮膚觀察窗,僅切開皮瓣暫時結扎穿支蒂血管,按不同時間點松開結扎后,利用灌注、標記技術記錄微血管吻合區(qū)的擴增情況,對不同時間點對血管密度進行分析,并力圖還原微血管的空間構筑。1.氧化鉛-明膠灌注造影：取48只SD大鼠隨機編號,利用氧化鉛-明膠灌注造影技術,每組分不同時間點對大鼠全身動脈進行一體化灌注,自大鼠腹部正中線處開始剝下整皮,應用X線進行攝影,用Scion Image Beta 4.02軟件對穿支體間吻合的血管密度及其變化進行分析；2.熒光示蹤技術標記：取8只SD大鼠,利用熒光示蹤技術標記血管內(nèi)皮細胞,應用去細胞技術去除適量的皮膚表皮細胞,在(雙光子)激光共聚焦顯微鏡下觀察、全層掃描,并力圖在MIMICS13.0中重建生理狀態(tài)下和非生理狀態(tài)下的微血管吻合的空間立體結構。主要實驗步驟如下：1.第一部分(1)提取、培養(yǎng)、收集、凍存MSCs:取體重約70±10g的幼齡SD大鼠12只,采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法提取、培養(yǎng)MSCs,并通過流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD90、CD45對該細胞進行鑒定,收集P3代MSCs凍存、備用。(2)大鼠皮膚血管體的分布：取成年SD大鼠6只,麻醉、脫毛后采用左心室灌注法灌注明膠。氧化鉛混懸液,并取整皮行X線掃描,觀察大鼠皮膚的主要穿肢體及其間的吻合位置,為下一步實驗中選擇穿支體提供借鑒和參考;(3)明確大鼠皮膚動、靜脈分布：取成年SD大鼠6只,根據(jù)X線掃描結果,取大鼠麻醉、脫毛后,選擇合適穿支體(左、右髂腰動脈穿支體)之間的微血管吻合作為觀察區(qū),安裝大鼠皮膚觀察窗,以靜脈留置針經(jīng)頸總動脈插管,并灌注Evans Blue溶液,錄像、記錄皮膚觀察窗內(nèi)血流變化、動靜脈伴行情況；2.第二部分取SD大鼠90只,麻醉、脫毛、制作皮瓣模型；安裝皮膚觀察窗后,再隨機編入單純皮膚觀察窗組、MSCs干預組和VEGF干預組,每組30只SD大鼠。MSCs干預組和VEGF干預組,在觀察窗內(nèi)分別按需局部注射MSCs和VEGF,余同單純皮膚觀察窗組。每組接著兩部分操作：(1)體視顯微鏡觀察：每組隨機選取6只SD大鼠,采用體視顯微鏡在不同時間點(Oh、24h、48h、72h、96h、6d、10d和16d)對觀察窗內(nèi)的穿支體間吻合區(qū)進行直視觀察、拍照記錄,照片導入Image Pro Plus6.0中,測量不同時間點的血管直徑,并做不同時間點和各組間對比：(2)分子生物學、組織化學檢測：每組24只大鼠,在D0(0h)、D1(24h)、D2 (48h)、D3(72h、D4 (96h)、D6(6d)、D10(10d)和D16(16d)等8個不同時間點獲取大鼠背部皮膚組織標本(每個時間點3只SD大鼠、每只大鼠取2部分皮膚組織,計6個皮膚組織標本),獲取的標本用于臟染色、免疫組化(第Ⅷ因子標記)的檢測；根據(jù)免疫組化結果,選取血管增生變化較明顯的3個時間點的標本行Rt-PCR檢測,明確皮膚內(nèi)VEGF-mRNA的表達水平規(guī)律。3.第三部分取SD大鼠,麻醉、脫毛后,切取皮瓣但不離斷穿支體的血管蒂,僅用較粗的絲線以活結結扎血管蒂部,再原位縫合皮膚(不安裝皮膚觀察窗)；按照單純皮膚觀察窗組總結的“微循環(huán)擴增規(guī)律”,按照不同時間點解除穿支體血管蒂的絲線結扎,行以下操作：(1)經(jīng)左心室行體循環(huán)動脈氧化鉛-明膠灌注：取大鼠48只,在DO(0h)、D1(24h)、D2(48h)、D3(72h)、D4(96h)、D6(6d)、D10(10d)和D16(16d)等8個不同時間點(每個時間點為6只),麻醉后經(jīng)左心室插管并關注明膠-氧化鉛混懸液,待明膠凝固后自腹部正中線處剝下整皮,應用X線進行攝影獲取圖片,導入Scion Image Beta 4.02中,計算穿支體以及體間吻合區(qū)的“谷峰灰度比”(穿支體部血管密度高,灰度值高,為“峰”；體區(qū)間吻合區(qū)灰度值低,為“谷”),分析穿支體區(qū)間血管吻合的密度及其變化規(guī)律；(2)經(jīng)左心室進行體循環(huán)動脈Evans Blue標記：取大鼠8只,按微血管擴增規(guī)律,在每個時間點進行灌注、標記。大鼠麻醉后經(jīng)左心室插管并灌洗體循環(huán)血管,再快速注入Evans Blue的生理鹽水溶液,以充填體循環(huán)血管、標記血管內(nèi)皮細胞,再部分去除皮膚表層細胞,經(jīng)腹正中線獲取大鼠整皮,置目標觀察區(qū)于激光共聚焦顯微鏡(或雙光子激光共聚焦顯微鏡)視野下觀察、全層掃描,獲得圖片導入MIMICS13.0進行三維重建,力圖還原各種狀態(tài)下的微血管吻合的空間立體結構。本課題技術路線圖如下：4.統(tǒng)計學處理以上三部分實驗,均采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件分析獲得數(shù)據(jù)。所有計量資料用叉±s表示。各組間比較方差齊時采用ONE-WAY ANOVA,方差不齊時采用Welch F方法；重復測量數(shù)據(jù)采用重復測量方差分析(REAPTED MEASURE ANOVA),P0.05為表示差異有統(tǒng)計學意義。結果第一部分：1.通過體外培養(yǎng)、擴增,得到均一性好、增殖能力強的大鼠系MSCs。倒置顯微鏡觀察呈原代MSCs-Rat主要呈梭型,部分呈三角形或多角形,集落樣貼壁生長,排列有明顯方向性,可成漩渦狀。傳代后細胞基本呈梭形,并呈現(xiàn)典型的放射狀生長,且5代以內(nèi)細胞形態(tài)較穩(wěn)定,細胞增殖速度較快。經(jīng)流式細胞儀檢測,結果顯示第3代MSCs的特異性表面標志物：CD90陽性,陽性率為96.8%,CD45陰性,陽性率為1.2%,提示第3代貼壁細胞主要是MSCs。2.經(jīng)明膠氧化鉛灌注-X線掃描,發(fā)現(xiàn)大鼠主要穿支體有：胸外側動脈(lateral thoracic artery,LTA)、胸背動脈(thoracodorsal artery,TDA)、肋下動脈(subcostal artery,SCA)、髂腰動脈(iliolumbar artery,ILA)、腹壁淺動脈(superficial epigastric artery,SEA)、臀上動脈(superior gluteal artery,SGA);其中上背部橫向跨中縫的吻合較明顯(即左、右胸背動脈之間以及左、右肋下動脈之間),上背部縱向的吻合也較明顯(胸背動脈和同側肋下動脈之間)；而在下背部,不管是縱向吻合(髂腰動脈和同側的肋下動脈之間),還是橫向跨中縫的吻合(左、右髂腰動脈之間),其吻合處的微血管分布較稀疏,吻合相對不明顯。尤其是左、右髂腰動脈穿支體之間橫向跨中縫的吻合區(qū),在本實驗中可作為觀察微血管吻合擴增的理想部位。3.通過安裝皮膚觀察窗、Evans Blue灌注,可觀察到觀察窗內(nèi)血管體的動脈最先出現(xiàn)染色,隨后范圍依次擴大,在20-30s之間,動脈著色而靜脈未著色,皮膚上的動、靜脈伴行關系清晰可見,肉眼觀察發(fā)現(xiàn)：動脈管徑較細、分布密度較低,靜脈則管徑粗,且分布范圍廣,基本遍布整個視野；至50s時,靜脈也被Evans Blue完全充填、藍染。第二部分：1.通過體式顯微鏡觀察不同時間點及不同組間處理對血管擴增率的影響,得到：不同時間點之間血管擴增率有顯著差異(1.14±0.14,1.33±0.18,1.504±0.26,1.97±0.32,1.98±0.47,1.75±0.49,1.89±0.39；F=32.965,P0.001)；各組不同時間點之間血管擴增均有顯著差異(F=11.726,P0.001；F=19.893,P0.001和F=6.262,P0.001)。MSCs干預組曲線呈逐漸上升,到達頂峰后又逐漸下降的趨勢；單純皮膚觀察窗組及VEGF干預組呈逐漸上升、到達頂峰后下降然后再上升的雙峰趨勢。三組之間血管擴增水平有顯著性差異(1.544±0.42,1.83±±0.52,1.58±0.39；F=6.981,P=0.005),在D3、D6、D10三個時間點有顯著性差異(P=0.014,P=0.037,P=0.003)。在D3、D6、D10三個時間點,單純皮膚觀察窗組血管擴增率顯著低于MSCs干預組,差異均有統(tǒng)計學意義；D6、D10兩個時間點,VEGF干預組血管擴增率顯著低于MSCs干預組,差異有統(tǒng)計學意義；7個時間點單純皮膚觀察窗組血管擴增率與VEGF干預組均無顯著性差異。不同時間點與不同組別之間無交互效應(F=2.064,P=0.059)。2.HE染色：單純皮膚觀察窗組可見中、小血管分布,但小、微血管的密度較低,D3微血管密度有所增加；MSC s干預組中,各時間點均可見大量小、微血管分布,以D6為最高；VEGF干預組中,各時間點可見中、小血管分布,也可見小、微血管分布,但密度相對較低,D3d微血管密度有所增加。3.免疫組化檢測皮膚切面內(nèi)皮細胞表達(第Ⅷ因子標記),觀察不同時間點及不同組間處理對皮瓣內(nèi)血管新生的影響：不同時間點之間血管新生有顯著差異(2.11±1.01,3.03±±1.53,2.39±±1.29,2.16±1.36,1.844±1.36,1.67±±1.28,1.27±0.99；F=50.695,P0.001)；各組不同時間點皮瓣內(nèi)血管新生均有顯著差異(F=15.751,P0.001；F=22.610,P0.001和F=24.676,P0.001)。三組曲線均呈逐漸上升,到達頂峰后又逐漸下降的趨勢。三組之間血管新生水平有顯著性差異(0.84±0.41,3.13±1.34,1.65±0.95；F=313.980,P0.001),除DO三組間無顯著性差異外,其余各個時間點均有顯著性差異,且均為P0.001。除D1外,單純皮膚觀察窗組血管新生顯著低于MSCs干預組和VEGF干預組,差異均有統(tǒng)計學意義；且除D1外,其他時間點MSCs干預組血管新生顯著高于VEGF干預組。不同時間點與不同組別之間存在交互效應(F=8.733,P0.001)。4.根據(jù)免疫組化及體式顯微鏡的觀察結果,選取D0、D3、D6作為Rt-PCR檢測時間點。不同時間點及不同組問皮膚VEGF-mRNA表達水平：不同時間點VEGF-mRNA表達水平有顯著差異(1.56±0.21,7.47±3.71,13.82±6.96；F=244.617,P0.001)；各組不同時間點之間VEGF-mRNA表達水平均有顯著差異(F=118.678,P0.001；F=98.100,P0.001和F=138.817,P0.001)。三組曲線呈上升趨勢,D3、D6時,、VEGF-mRNA表達水平均顯著高于DO,且D6點VEGF-mRNA表達水平顯著高于D3。三組之間VEGF-mRNA表達水平有顯著性差異(4.47±2.84,12.08±9.20,6.30±3.97；F=110.135,P0.001),除DO外,D3、D6兩個時間點有顯著性差異(P0.001,P0.001)。在D3、D6兩個時間點,單純皮膚觀察窗組VEGF-mRNA表達水平顯著低于MSCs干預組和VEGF干預組,差異均有統(tǒng)計學意義；D3、D6兩個時間點,VEGF干預組VEGF-mRNA表達水平顯著低于MSCs干預組,差異有統(tǒng)計學意義。不同時間點與不同組別之問存在交互效應(F=33.552,P0.001)。第三部分：1.X線掃描：不同時間點的X線谷-峰灰度比有顯著性差異；與DO組相比,D2、D3、D4、D6、D10的谷峰密度均顯著增多(P=0.001,P0.001,P0.001,P=0.013,P=0.010,P=0.036)；與D1相比,D16谷峰密度顯著降低(P=0.009)；與D2組相比,D6、D10、D16的谷峰密度均顯著增多(P=0.038,P=0.036,P0.001)；與D3組相比,D4、D6、D10、D16的谷峰密度均顯著增多(P=0.038,P=0.004,P=0.007,P0.001)。2.血管內(nèi)皮細胞經(jīng)熒光劑標記、部分去除皮膚表皮層細胞后,利用激光共聚焦顯微鏡對全層皮膚進行掃描,能較好地顯示小血管,利用MIMICS 13.0等軟件,可以對血管體區(qū)之間的微血管吻合進行三維空間構筑的重建。結論1.在本課題組前期研究結果的基礎上,成功改良、制作了大鼠背部皮膚觀察窗,應用后可在直視下實時觀察血管及其擴增情況,其適用于在活體上應用、研究生理狀態(tài)下的血管；2.通過皮膚觀察窗發(fā)現(xiàn)：本實驗設計的皮瓣模型中,能有效誘使左、右髂腰動脈穿支體之間choke vessels的擴增；皮膚擴增呈現(xiàn)“雙峰”規(guī)律。給予MSCs干預后,微血管的擴增速度提前,擴增程度顯著增加；給予VEGF干預后,微血管密度增加,血管擴增速度有所提前,擴增程度增加不明顯。3.利用明膠-氧化鉛灌注法進行全身體循環(huán)動脈灌注,能較好顯示皮膚血管,可以明確皮膚穿支血管體的分布,在制作皮瓣模型后微血管的擴增過程中,能較好地顯示微血管密度(灰度值)變化,在進行血管研究時,仍然是一種較好實驗手段。4.本實驗以E vans blue標記皮膚血管內(nèi)皮細胞,結合激光共聚焦顯微鏡對全層皮膚進行無創(chuàng)、連續(xù)掃描,獲取的圖片信息在MIMICS中,成功對血管形態(tài)尤其是微血管的三維空間構筑進行重建。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R322
【圖文】：

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本文編號：2800073