【摘要】：研究背景各種原因引起機(jī)體的組織缺損、深層組織(如筋膜、肌肉、骨、血管或神經(jīng)等)外露,包括創(chuàng)傷、腫瘤切除術(shù)后、糖尿病潰瘍、壞疽、褥瘡,以及先天性畸形等,都需要進(jìn)行修復(fù)。臨床上最常用的修復(fù)方法是：基于機(jī)體自身某局部的一穿支血管,切取以該血管血供為基礎(chǔ)的皮膚或復(fù)合組織作為供體,對(duì)缺損部位進(jìn)行修復(fù)、重建,阻止深層組織繼續(xù)外露。此類(lèi)自體移植、用于修復(fù)缺損的“以某穿支血管為基礎(chǔ)的皮膚組織塊”,即可稱(chēng)為穿支皮瓣(Perforator Flap)。穿支皮瓣是最近幾十年伴隨顯微設(shè)備發(fā)展起來(lái)的、用于修復(fù)組織缺損的一項(xiàng)新技術(shù),它是在傳統(tǒng)的肌皮瓣術(shù)式基礎(chǔ)之上,僅選擇性切取供養(yǎng)皮瓣的穿支血管,并以該穿支血管作為血管蒂進(jìn)行移植修復(fù),保留了供區(qū)的主要血管,且無(wú)須攜帶肌肉組織,從而大大地減少了對(duì)供區(qū)的繼發(fā)性損傷,因而得以廣泛地應(yīng)用于臨床。然而,單純的穿支皮瓣僅以管徑細(xì)小的皮膚穿動(dòng)脈為蒂進(jìn)行取瓣,穿支血管并非主干,故其供皮面積偏小。在一些較大的組織缺損(如燒傷、交通傷等,損傷面積較大且損傷嚴(yán)重),其損傷面積常大大地超過(guò)單個(gè)軸型血管穿支皮瓣所能覆蓋的范圍,這便給臨床修復(fù)重建帶來(lái)了極大的困難,為適應(yīng)這種大面積修復(fù)的需要,臨床上也隨之出現(xiàn)了基于兩個(gè)或兩個(gè)以上穿支血管的大皮瓣或超大皮(組織)瓣,因此,如何對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)大切取便成了皮瓣外科的一個(gè)重要課題。對(duì)于這些超大型的聯(lián)合皮(組織)瓣而言,其血液供應(yīng)的穩(wěn)定性、穿支血管體之間微血管的有效吻合情況等,是決定其成活率的關(guān)鍵因素。早在1987年,Taylor等應(yīng)用血管造影技術(shù)對(duì)人體及其一些哺乳動(dòng)物的皮動(dòng)脈進(jìn)行了細(xì)致入微的研究,統(tǒng)計(jì)出人體平均有口徑≥0.5mm的皮膚穿支血管374支,可切取近40個(gè)穿支血管皮瓣。并根據(jù)皮膚內(nèi)血管由深向淺呈立體三維分布的特點(diǎn)與規(guī)律,提出了“Vascular Territories"(血管體,angiosome)的概念,他們認(rèn)為,每一支知名的皮膚血管的供區(qū)都不僅僅局限于其分布范圍內(nèi)的皮膚及皮下組織,而是一個(gè)包含有同一區(qū)域內(nèi)相應(yīng)的肌肉、肌腱、骨骼等多種組織在內(nèi)的三維組織塊,稱(chēng)之為“血管體”(angiosomes),全身體表共可劃分為40多個(gè)這樣的“血管體區(qū)”,兩“血管體”之間則借微血管吻合(即choke vesse ls)互相連接。血管體(或稱(chēng)之為血管分布區(qū)域)新這個(gè)概念的提出,不但促進(jìn)了多種皮瓣新供區(qū)的發(fā)現(xiàn)、新術(shù)式的產(chǎn)生,而且也促進(jìn)了對(duì)傳統(tǒng)皮瓣移植方式的改進(jìn)。差不多同一時(shí)期,Cormack等通過(guò)分析相鄰血管體之間的關(guān)系,將皮膚的血管供區(qū)依次分為三個(gè)層次：解剖學(xué)供區(qū),血流動(dòng)力學(xué)供區(qū)以及潛在供區(qū)。即：1.某一源動(dòng)脈呈樹(shù)形分布的立體區(qū)域,其所到之處為解剖學(xué)供區(qū)(anatomical territory),'除與Taylor等提出的“血管體區(qū)”相當(dāng),是最基本的血管供區(qū)。2.每一個(gè)解剖學(xué)供區(qū)與其周?chē)噜弰?dòng)脈之間均有豐富的吻合。當(dāng)一側(cè)血管被切斷或阻斷時(shí),則其下游血管內(nèi)的血壓下降。此時(shí),解剖學(xué)供區(qū)血管內(nèi)的血流就會(huì)跨越原來(lái)的吻合部位(choke vessels)向其體區(qū)進(jìn)行供血。這種緊鄰解剖學(xué)供區(qū)的擴(kuò)張部分被稱(chēng)之為血流動(dòng)力學(xué)供區(qū)((lynamic territory)。3.在跨越動(dòng)力學(xué)供區(qū)的基礎(chǔ)上,若再繼續(xù)向遠(yuǎn)鄰的供區(qū)延伸,則稱(chēng)其為潛力供區(qū)(potential territory)。這表明：有可能將皮瓣從解剖學(xué)供區(qū)向緊鄰的動(dòng)力學(xué)供區(qū)擴(kuò)張,得到較大的皮瓣,若再繼續(xù)向遠(yuǎn)鄰的潛力供區(qū)延伸,則可得到更大的皮瓣。但是,能否成功擴(kuò)大切取的前提是必須知道：不同供區(qū)之間是否存在有效的吻合血管(即choke vessels),能夠建立起“新的血液循環(huán)體系”將三個(gè)不同的小供區(qū)變成一個(gè)大供區(qū)。因此,各供區(qū)間血管網(wǎng)的形態(tài)學(xué)特征,其血流動(dòng)力學(xué)特征,以及如何加強(qiáng)體區(qū)間血管的有效溝通便成了皮瓣外科最大、最重要也是最難的課題。既往對(duì)于穿支體間微血管吻合的研究,多在于尸體層面進(jìn)行的大體灌注,由于尸體的“非生理性”,對(duì)其小血管的研究勢(shì)必不能反映活體的生理狀態(tài)；再則,由于灌注劑的類(lèi)型、粘稠度、灌注壓力等因素的限制,僅灌注效果就未必能取得良好狀態(tài)。本課題選取SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,制作皮瓣模型,通過(guò)安裝自行設(shè)計(jì)、改良的皮膚觀察窗,在直視下進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察,對(duì)組織進(jìn)行分子水平表達(dá)物質(zhì)的測(cè)定,總結(jié)血管體間吻合的擴(kuò)增規(guī)律。在此基礎(chǔ)上,選擇不同時(shí)間段進(jìn)行灌注、標(biāo)記微血管,以期能重建、還原微血管吻合的空間結(jié)構(gòu)。目的1.對(duì)實(shí)驗(yàn)組前期設(shè)計(jì)的皮膚觀察窗進(jìn)行改良,以期重新設(shè)計(jì)并制作出更符合本實(shí)驗(yàn)需求的皮膚觀察窗；采用大鼠皮膚觀察窗,直視下觀察體區(qū)間微血管吻合(且choke vessels)在不同時(shí)間點(diǎn)的擴(kuò)增情況及吻合變化,并初步得出其變化規(guī)律：2.采用大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells of rat, MSCs-rat)和血管內(nèi)皮細(xì)胞因子(vascular endothelial growth factor of rat, VEGF-rat)這兩種干預(yù)方法,觀察它們對(duì)于choke vessels擴(kuò)增過(guò)程的影響；3.獲取組織進(jìn)行Rt-PCR、免疫組化等檢測(cè),確定分子表達(dá)物變化規(guī)律；4.利用明膠-氧化鉛對(duì)大鼠全身動(dòng)脈進(jìn)行灌注,取皮行X攝片,計(jì)算、比對(duì)不同組的各時(shí)間點(diǎn)微血管吻合處的微血管密度(灰度值)；5.結(jié)合Evans Blue對(duì)血管內(nèi)皮標(biāo)記,初步探討激光共聚焦顯微鏡在大鼠皮膚血管三維重建中的應(yīng)用價(jià)值,以期研究大鼠皮膚相鄰血管體之間choke vessels形態(tài)學(xué)特征,并探索出精度更高而又簡(jiǎn)便實(shí)用的血管3D可視化新技術(shù)。方法第一部分,是本課題前期實(shí)驗(yàn)部分：取成年SD大鼠6只,通過(guò)氧化鉛-明膠造影初步了解大鼠背部主要穿支體的分布；取成年SD大鼠6只,安裝皮膚觀察窗后(不切取皮瓣、不離斷穿支蒂),通過(guò)錄像初步了解大鼠皮膚穿支動(dòng)、靜脈伴行情況；另外,選取體重為70±10g的幼齡SD大鼠12只,自行提取、培養(yǎng)MSCs,檢測(cè)其純度合格后凍存在-80℃的冰箱中,以滿(mǎn)足后期實(shí)驗(yàn)的需要；第二部分、第三部分是本課題主體實(shí)驗(yàn)部分。第二部分：選取SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過(guò)制作SD大鼠皮瓣模型(即：使得相鄰兩個(gè)穿支血管的體區(qū)互為動(dòng)力學(xué)供區(qū)),在背部皮膚上安裝自行設(shè)計(jì)、改良的皮膚觀察窗,隨機(jī)編號(hào)分三組,分別為單純皮窗組、MSCs干預(yù)組(皮窗+MSCs組)和VEGF干預(yù)組(皮窗+VEGF組)：1.體視顯微鏡觀察部分：取18只SD大鼠,隨機(jī)編號(hào)分三組。(1)單純皮窗組通過(guò)安裝皮膚觀察窗,在體視顯微鏡下對(duì)大鼠背部皮膚血管體間的微血管吻合(choke vessels)處的管徑、密度變化情況,以及微血管吻合處的延時(shí)擴(kuò)增情況進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的活體實(shí)時(shí)觀察；(2)MSCs干預(yù)組和VEGF干預(yù)組,分別加入MSCs和VEGF這兩個(gè)干預(yù)因素,再通過(guò)觀察窗,在體視顯微鏡下對(duì)大鼠背部皮膚血管體間的微血管吻合處的管徑、密度變化情況,以及微血管吻合處的延時(shí)擴(kuò)增情況進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的活體實(shí)時(shí)觀察,并探索常見(jiàn)的血管生成相關(guān)的分子因素對(duì)微血管吻合擴(kuò)增的影響；2.實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)部分：取72只SD大鼠,隨機(jī)編號(hào)分三組：在各組大鼠背部觀察區(qū)皮膚上,按照不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取材,行HE染色、Rt-PCR、免疫組化等檢查,檢測(cè)毛細(xì)血管表達(dá)水平和分子表達(dá)物的表達(dá)水平(VEGF-mRNA),并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件在不同時(shí)間點(diǎn)及不同組別間作比對(duì),總結(jié)血管體之間的微血管吻合的變化規(guī)律,探究其受影響的因素；第三部分,不分組、不安裝皮膚觀察窗,僅切開(kāi)皮瓣暫時(shí)結(jié)扎穿支蒂血管,按不同時(shí)間點(diǎn)松開(kāi)結(jié)扎后,利用灌注、標(biāo)記技術(shù)記錄微血管吻合區(qū)的擴(kuò)增情況,對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)血管密度進(jìn)行分析,并力圖還原微血管的空間構(gòu)筑。1.氧化鉛-明膠灌注造影：取48只SD大鼠隨機(jī)編號(hào),利用氧化鉛-明膠灌注造影技術(shù),每組分不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠全身動(dòng)脈進(jìn)行一體化灌注,自大鼠腹部正中線處開(kāi)始剝下整皮,應(yīng)用X線進(jìn)行攝影,用Scion Image Beta 4.02軟件對(duì)穿支體間吻合的血管密度及其變化進(jìn)行分析；2.熒光示蹤技術(shù)標(biāo)記：取8只SD大鼠,利用熒光示蹤技術(shù)標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞,應(yīng)用去細(xì)胞技術(shù)去除適量的皮膚表皮細(xì)胞,在(雙光子)激光共聚焦顯微鏡下觀察、全層掃描,并力圖在MIMICS13.0中重建生理狀態(tài)下和非生理狀態(tài)下的微血管吻合的空間立體結(jié)構(gòu)。主要實(shí)驗(yàn)步驟如下：1.第一部分(1)提取、培養(yǎng)、收集、凍存MSCs:取體重約70±10g的幼齡SD大鼠12只,采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法提取、培養(yǎng)MSCs,并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD90、CD45對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行鑒定,收集P3代MSCs凍存、備用。(2)大鼠皮膚血管體的分布：取成年SD大鼠6只,麻醉、脫毛后采用左心室灌注法灌注明膠。氧化鉛混懸液,并取整皮行X線掃描,觀察大鼠皮膚的主要穿肢體及其間的吻合位置,為下一步實(shí)驗(yàn)中選擇穿支體提供借鑒和參考;(3)明確大鼠皮膚動(dòng)、靜脈分布：取成年SD大鼠6只,根據(jù)X線掃描結(jié)果,取大鼠麻醉、脫毛后,選擇合適穿支體(左、右髂腰動(dòng)脈穿支體)之間的微血管吻合作為觀察區(qū),安裝大鼠皮膚觀察窗,以靜脈留置針經(jīng)頸總動(dòng)脈插管,并灌注Evans Blue溶液,錄像、記錄皮膚觀察窗內(nèi)血流變化、動(dòng)靜脈伴行情況；2.第二部分取SD大鼠90只,麻醉、脫毛、制作皮瓣模型；安裝皮膚觀察窗后,再隨機(jī)編入單純皮膚觀察窗組、MSCs干預(yù)組和VEGF干預(yù)組,每組30只SD大鼠。MSCs干預(yù)組和VEGF干預(yù)組,在觀察窗內(nèi)分別按需局部注射MSCs和VEGF,余同單純皮膚觀察窗組。每組接著兩部分操作：(1)體視顯微鏡觀察：每組隨機(jī)選取6只SD大鼠,采用體視顯微鏡在不同時(shí)間點(diǎn)(Oh、24h、48h、72h、96h、6d、10d和16d)對(duì)觀察窗內(nèi)的穿支體間吻合區(qū)進(jìn)行直視觀察、拍照記錄,照片導(dǎo)入Image Pro Plus6.0中,測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)的血管直徑,并做不同時(shí)間點(diǎn)和各組間對(duì)比：(2)分子生物學(xué)、組織化學(xué)檢測(cè)：每組24只大鼠,在D0(0h)、D1(24h)、D2 (48h)、D3(72h、D4 (96h)、D6(6d)、D10(10d)和D16(16d)等8個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)獲取大鼠背部皮膚組織標(biāo)本(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只SD大鼠、每只大鼠取2部分皮膚組織,計(jì)6個(gè)皮膚組織標(biāo)本),獲取的標(biāo)本用于臟染色、免疫組化(第Ⅷ因子標(biāo)記)的檢測(cè)；根據(jù)免疫組化結(jié)果,選取血管增生變化較明顯的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)本行Rt-PCR檢測(cè),明確皮膚內(nèi)VEGF-mRNA的表達(dá)水平規(guī)律。3.第三部分取SD大鼠,麻醉、脫毛后,切取皮瓣但不離斷穿支體的血管蒂,僅用較粗的絲線以活結(jié)結(jié)扎血管蒂部,再原位縫合皮膚(不安裝皮膚觀察窗)；按照單純皮膚觀察窗組總結(jié)的“微循環(huán)擴(kuò)增規(guī)律”,按照不同時(shí)間點(diǎn)解除穿支體血管蒂的絲線結(jié)扎,行以下操作：(1)經(jīng)左心室行體循環(huán)動(dòng)脈氧化鉛-明膠灌注：取大鼠48只,在DO(0h)、D1(24h)、D2(48h)、D3(72h)、D4(96h)、D6(6d)、D10(10d)和D16(16d)等8個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)為6只),麻醉后經(jīng)左心室插管并關(guān)注明膠-氧化鉛混懸液,待明膠凝固后自腹部正中線處剝下整皮,應(yīng)用X線進(jìn)行攝影獲取圖片,導(dǎo)入Scion Image Beta 4.02中,計(jì)算穿支體以及體間吻合區(qū)的“谷峰灰度比”(穿支體部血管密度高,灰度值高,為“峰”；體區(qū)間吻合區(qū)灰度值低,為“谷”),分析穿支體區(qū)間血管吻合的密度及其變化規(guī)律；(2)經(jīng)左心室進(jìn)行體循環(huán)動(dòng)脈Evans Blue標(biāo)記：取大鼠8只,按微血管擴(kuò)增規(guī)律,在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行灌注、標(biāo)記。大鼠麻醉后經(jīng)左心室插管并灌洗體循環(huán)血管,再快速注入Evans Blue的生理鹽水溶液,以充填體循環(huán)血管、標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞,再部分去除皮膚表層細(xì)胞,經(jīng)腹正中線獲取大鼠整皮,置目標(biāo)觀察區(qū)于激光共聚焦顯微鏡(或雙光子激光共聚焦顯微鏡)視野下觀察、全層掃描,獲得圖片導(dǎo)入MIMICS13.0進(jìn)行三維重建,力圖還原各種狀態(tài)下的微血管吻合的空間立體結(jié)構(gòu)。本課題技術(shù)路線圖如下：4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以上三部分實(shí)驗(yàn),均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析獲得數(shù)據(jù)。所有計(jì)量資料用叉±s表示。各組間比較方差齊時(shí)采用ONE-WAY ANOVA,方差不齊時(shí)采用Welch F方法；重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析(REAPTED MEASURE ANOVA),P0.05為表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果第一部分：1.通過(guò)體外培養(yǎng)、擴(kuò)增,得到均一性好、增殖能力強(qiáng)的大鼠系MSCs。倒置顯微鏡觀察呈原代MSCs-Rat主要呈梭型,部分呈三角形或多角形,集落樣貼壁生長(zhǎng),排列有明顯方向性,可成漩渦狀。傳代后細(xì)胞基本呈梭形,并呈現(xiàn)典型的放射狀生長(zhǎng),且5代以?xún)?nèi)細(xì)胞形態(tài)較穩(wěn)定,細(xì)胞增殖速度較快。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè),結(jié)果顯示第3代MSCs的特異性表面標(biāo)志物：CD90陽(yáng)性,陽(yáng)性率為96.8%,CD45陰性,陽(yáng)性率為1.2%,提示第3代貼壁細(xì)胞主要是MSCs。2.經(jīng)明膠氧化鉛灌注-X線掃描,發(fā)現(xiàn)大鼠主要穿支體有：胸外側(cè)動(dòng)脈(lateral thoracic artery,LTA)、胸背動(dòng)脈(thoracodorsal artery,TDA)、肋下動(dòng)脈(subcostal artery,SCA)、髂腰動(dòng)脈(iliolumbar artery,ILA)、腹壁淺動(dòng)脈(superficial epigastric artery,SEA)、臀上動(dòng)脈(superior gluteal artery,SGA);其中上背部橫向跨中縫的吻合較明顯(即左、右胸背動(dòng)脈之間以及左、右肋下動(dòng)脈之間),上背部縱向的吻合也較明顯(胸背動(dòng)脈和同側(cè)肋下動(dòng)脈之間)；而在下背部,不管是縱向吻合(髂腰動(dòng)脈和同側(cè)的肋下動(dòng)脈之間),還是橫向跨中縫的吻合(左、右髂腰動(dòng)脈之間),其吻合處的微血管分布較稀疏,吻合相對(duì)不明顯。尤其是左、右髂腰動(dòng)脈穿支體之間橫向跨中縫的吻合區(qū),在本實(shí)驗(yàn)中可作為觀察微血管吻合擴(kuò)增的理想部位。3.通過(guò)安裝皮膚觀察窗、Evans Blue灌注,可觀察到觀察窗內(nèi)血管體的動(dòng)脈最先出現(xiàn)染色,隨后范圍依次擴(kuò)大,在20-30s之間,動(dòng)脈著色而靜脈未著色,皮膚上的動(dòng)、靜脈伴行關(guān)系清晰可見(jiàn),肉眼觀察發(fā)現(xiàn)：動(dòng)脈管徑較細(xì)、分布密度較低,靜脈則管徑粗,且分布范圍廣,基本遍布整個(gè)視野；至50s時(shí),靜脈也被Evans Blue完全充填、藍(lán)染。第二部分：1.通過(guò)體式顯微鏡觀察不同時(shí)間點(diǎn)及不同組間處理對(duì)血管擴(kuò)增率的影響,得到：不同時(shí)間點(diǎn)之間血管擴(kuò)增率有顯著差異(1.14±0.14,1.33±0.18,1.504±0.26,1.97±0.32,1.98±0.47,1.75±0.49,1.89±0.39；F=32.965,P0.001)；各組不同時(shí)間點(diǎn)之間血管擴(kuò)增均有顯著差異(F=11.726,P0.001；F=19.893,P0.001和F=6.262,P0.001)。MSCs干預(yù)組曲線呈逐漸上升,到達(dá)頂峰后又逐漸下降的趨勢(shì)；單純皮膚觀察窗組及VEGF干預(yù)組呈逐漸上升、到達(dá)頂峰后下降然后再上升的雙峰趨勢(shì)。三組之間血管擴(kuò)增水平有顯著性差異(1.544±0.42,1.83±±0.52,1.58±0.39；F=6.981,P=0.005),在D3、D6、D10三個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異(P=0.014,P=0.037,P=0.003)。在D3、D6、D10三個(gè)時(shí)間點(diǎn),單純皮膚觀察窗組血管擴(kuò)增率顯著低于MSCs干預(yù)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D6、D10兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),VEGF干預(yù)組血管擴(kuò)增率顯著低于MSCs干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；7個(gè)時(shí)間點(diǎn)單純皮膚觀察窗組血管擴(kuò)增率與VEGF干預(yù)組均無(wú)顯著性差異。不同時(shí)間點(diǎn)與不同組別之間無(wú)交互效應(yīng)(F=2.064,P=0.059)。2.HE染色：?jiǎn)渭兤つw觀察窗組可見(jiàn)中、小血管分布,但小、微血管的密度較低,D3微血管密度有所增加；MSC s干預(yù)組中,各時(shí)間點(diǎn)均可見(jiàn)大量小、微血管分布,以D6為最高；VEGF干預(yù)組中,各時(shí)間點(diǎn)可見(jiàn)中、小血管分布,也可見(jiàn)小、微血管分布,但密度相對(duì)較低,D3d微血管密度有所增加。3.免疫組化檢測(cè)皮膚切面內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)(第Ⅷ因子標(biāo)記),觀察不同時(shí)間點(diǎn)及不同組間處理對(duì)皮瓣內(nèi)血管新生的影響：不同時(shí)間點(diǎn)之間血管新生有顯著差異(2.11±1.01,3.03±±1.53,2.39±±1.29,2.16±1.36,1.844±1.36,1.67±±1.28,1.27±0.99；F=50.695,P0.001)；各組不同時(shí)間點(diǎn)皮瓣內(nèi)血管新生均有顯著差異(F=15.751,P0.001；F=22.610,P0.001和F=24.676,P0.001)。三組曲線均呈逐漸上升,到達(dá)頂峰后又逐漸下降的趨勢(shì)。三組之間血管新生水平有顯著性差異(0.84±0.41,3.13±1.34,1.65±0.95；F=313.980,P0.001),除DO三組間無(wú)顯著性差異外,其余各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有顯著性差異,且均為P0.001。除D1外,單純皮膚觀察窗組血管新生顯著低于MSCs干預(yù)組和VEGF干預(yù)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且除D1外,其他時(shí)間點(diǎn)MSCs干預(yù)組血管新生顯著高于VEGF干預(yù)組。不同時(shí)間點(diǎn)與不同組別之間存在交互效應(yīng)(F=8.733,P0.001)。4.根據(jù)免疫組化及體式顯微鏡的觀察結(jié)果,選取D0、D3、D6作為Rt-PCR檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。不同時(shí)間點(diǎn)及不同組問(wèn)皮膚VEGF-mRNA表達(dá)水平：不同時(shí)間點(diǎn)VEGF-mRNA表達(dá)水平有顯著差異(1.56±0.21,7.47±3.71,13.82±6.96；F=244.617,P0.001)；各組不同時(shí)間點(diǎn)之間VEGF-mRNA表達(dá)水平均有顯著差異(F=118.678,P0.001；F=98.100,P0.001和F=138.817,P0.001)。三組曲線呈上升趨勢(shì),D3、D6時(shí),、VEGF-mRNA表達(dá)水平均顯著高于DO,且D6點(diǎn)VEGF-mRNA表達(dá)水平顯著高于D3。三組之間VEGF-mRNA表達(dá)水平有顯著性差異(4.47±2.84,12.08±9.20,6.30±3.97；F=110.135,P0.001),除DO外,D3、D6兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異(P0.001,P0.001)。在D3、D6兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),單純皮膚觀察窗組VEGF-mRNA表達(dá)水平顯著低于MSCs干預(yù)組和VEGF干預(yù)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D3、D6兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),VEGF干預(yù)組VEGF-mRNA表達(dá)水平顯著低于MSCs干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同時(shí)間點(diǎn)與不同組別之問(wèn)存在交互效應(yīng)(F=33.552,P0.001)。第三部分：1.X線掃描：不同時(shí)間點(diǎn)的X線谷-峰灰度比有顯著性差異；與DO組相比,D2、D3、D4、D6、D10的谷峰密度均顯著增多(P=0.001,P0.001,P0.001,P=0.013,P=0.010,P=0.036)；與D1相比,D16谷峰密度顯著降低(P=0.009)；與D2組相比,D6、D10、D16的谷峰密度均顯著增多(P=0.038,P=0.036,P0.001)；與D3組相比,D4、D6、D10、D16的谷峰密度均顯著增多(P=0.038,P=0.004,P=0.007,P0.001)。2.血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)熒光劑標(biāo)記、部分去除皮膚表皮層細(xì)胞后,利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)全層皮膚進(jìn)行掃描,能較好地顯示小血管,利用MIMICS 13.0等軟件,可以對(duì)血管體區(qū)之間的微血管吻合進(jìn)行三維空間構(gòu)筑的重建。結(jié)論1.在本課題組前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,成功改良、制作了大鼠背部皮膚觀察窗,應(yīng)用后可在直視下實(shí)時(shí)觀察血管及其擴(kuò)增情況,其適用于在活體上應(yīng)用、研究生理狀態(tài)下的血管；2.通過(guò)皮膚觀察窗發(fā)現(xiàn)：本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的皮瓣模型中,能有效誘使左、右髂腰動(dòng)脈穿支體之間choke vessels的擴(kuò)增；皮膚擴(kuò)增呈現(xiàn)“雙峰”規(guī)律。給予MSCs干預(yù)后,微血管的擴(kuò)增速度提前,擴(kuò)增程度顯著增加；給予VEGF干預(yù)后,微血管密度增加,血管擴(kuò)增速度有所提前,擴(kuò)增程度增加不明顯。3.利用明膠-氧化鉛灌注法進(jìn)行全身體循環(huán)動(dòng)脈灌注,能較好顯示皮膚血管,可以明確皮膚穿支血管體的分布,在制作皮瓣模型后微血管的擴(kuò)增過(guò)程中,能較好地顯示微血管密度(灰度值)變化,在進(jìn)行血管研究時(shí),仍然是一種較好實(shí)驗(yàn)手段。4.本實(shí)驗(yàn)以E vans blue標(biāo)記皮膚血管內(nèi)皮細(xì)胞,結(jié)合激光共聚焦顯微鏡對(duì)全層皮膚進(jìn)行無(wú)創(chuàng)、連續(xù)掃描,獲取的圖片信息在MIMICS中,成功對(duì)血管形態(tài)尤其是微血管的三維空間構(gòu)筑進(jìn)行重建。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R322
【圖文】：

－；＾１６．ＭＳＣＳ的移植逡逑（１）取巧細(xì)胞，同細(xì)胞傳代的（１）邋￣邋（５）步歘，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，倒去逡逑離也管中的上清液，ＰＢＳ溶液洗}悖脖楹�，用生理盐水配成细胞悬液，调整细辶x習(xí)ǘ任福埃兀保埃迪赴玻瞪劍誨義希ǎ玻┰詿笫蟊巢科し艄鄄齏澳�，笔|埽∪。蹈齬潭ㄎ恢茫茫擔(dān)酰煳㈠義狹孔⑸淦鰨詮鄄齏按植科し艫鈉つ謐⑸洌瞪劍闈傻閬赴海ǎ停櫻茫笙赴ㄥ義隙任福埃兀保埃蹈觶玻瞪劍�，每３虤e貝危⒃諤迨酉暈⒕迪鹿鄄�、数码相机艕勒做埩x霞鍬跡誨義希步峁義希玻貝笫篤し粞芄鄄齏吧杓啤⒏牧煎義匣詒究翁庾榍捌謔笛榻峁�，晤U親孕猩杓啤⒏牧計(jì)し艄鄄齏埃ㄆご埃┨族義霞ㄍ跡保保�。辶x

本文編號(hào)：2800073