【摘要】： 尾加壓素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）最初是從魚尾部垂體分離出來的神經(jīng)肽，為迄今所知縮血管作用最強(qiáng)的活性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)UⅡ可能具有心血管和中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)作用，并提示UⅡ的心血管作用可能與NO有關(guān)。目前，研究已證實(shí)UⅡ的特異性受體為孤兒G蛋白偶聯(lián)受體GPR14。但有關(guān)GPR14在大鼠心血管和腦組織的表達(dá)和分布以及UⅡ?qū)π募〖?xì)胞的作用及其機(jī)制尚有爭議。為進(jìn)一步闡明UⅡ的心血管作用及其機(jī)制以及UⅡ受體GPR14在心血管和腦組織的表達(dá)與分布，本研究采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和原位雜交組織化學(xué)等技術(shù)，考察了受體GPR14在大鼠心血管組織及心肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和分布；應(yīng)用離體灌流大鼠心臟模型及蛋白印跡雜交等技術(shù)，觀察了大鼠UⅡ?qū)π呐K的作用，初步探討了其與NOS/NO合成系統(tǒng)的關(guān)系及機(jī)制；采用Bradford法和MTT法檢測了UⅡ?qū)π募〖?xì)胞總蛋白合成和細(xì)胞活力的影響，分析UⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大作用，觀察了UⅡ?qū)π募〖?xì)胞NOS/NO合成系統(tǒng)的影響，初步探討了UⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大作用與NOS/NO合成系統(tǒng)的關(guān)系及可能機(jī)制；此外，還觀察了受體GPR14在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)和分布。本研究主要結(jié)果如下。 一、UⅡ受體GPR14 mRNA在大鼠心血管及心肌細(xì)胞的表達(dá)與分布 1． GPR14 mRNA在大鼠左心室、左心房、胸主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈等心血管組織有表達(dá)，其中左心室表達(dá)豐度最高。 2．GPR14 mRNA分布于大鼠心肌組織，陽性雜交信號(hào)主要位于心肌細(xì)胞胞漿。 3．原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞能表達(dá)GPR14 mRNA，陽性雜交信號(hào)主要分布于心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的胞漿。 二、大鼠UⅡ?qū)﹄x體灌流大鼠心臟的作用及其機(jī)制 1．分別給予離體灌流大鼠心臟6.66(10-5 、6.66(10-4、6.66(10-3、6.66(10-2和0.67μg的UⅡ5min后，冠脈流量由對照組的9.22±0.80分別增加至9.95±0.37、9.98±0.51、10.13±0.68、10.28±0.43和10.49±0.56 ml/min·g-1protein，呈劑量依賴性；給予6.66(10-2μg UⅡ，5min后冠脈流量最大，然后緩慢下降，但仍高于對照組；5、10、15、20、25和30min后，冠脈流量分別增加至10.28±0.43、9.71±0.30、9.60±0.47、9.48±0.56、9.29±0.46和9.27±0.77ml/min·g-1protein，WP=6呈時(shí)間依賴性。UⅡ能輕度增加灌流心臟的心率、LVSP和+dP/dtmax（P＞0.05），而LVDEP和-dP/dtmax則無顯著性變化。 2． 單獨(dú)給予NOS抑制劑L-NAME 30.6μg后，冠脈流量為7.90±0.84 ml/min·g-1protein；心率為193±19次/min；LVSP為9.19±0.78 kPa；+dP/dtmax為336±12kPa/s；L-NAME預(yù)處理20min后再給予UⅡ，冠脈流量、心率、LVSP和+dP/dtmax分別為8.65±0.56ml/min·g-1protein、201±11次/min、9.19±0.78kPa和344±26kPa/s，LVDEP和-dP/dtmax與UⅡ劑量為6.66(10-2μg組相比無顯著性變化；NO供體SNP 3.38(103μg預(yù)處理20min后再給予UⅡ，冠脈流量、心率、LVSP、LVDEP和±dP/dtmax均無顯著性變化。 3． 單獨(dú)給予PKC激動(dòng)劑PMA 0.70μg，心率為240±22次/min；PAM預(yù)處理20min后再給予UⅡ，心率增加至259±21次/min，而冠脈流量、LVSP、LVDEP和±dP/dtmax與UⅡ劑量為6.66(10-2μg組相比均無顯著性變化。單獨(dú)給予PKC抑制劑Stau 5.29(10-5μg，冠脈流量、LVSP和+dP/dtmax分別為7.90±0.43ml/min·g-1protein、10.21±0.84kPa和332±25kPa/s；Stau 5.29(10-5μg預(yù)處理20min后再給予UⅡ，冠脈流量、LVSP和+dP/dtmax分別為9.10±0.72 ml/min·g-1protein、10.45±0.94 kPa 和328±23 kPa/s，而心率、LVDEP和-dP/dtmax無顯著性變化。 4．分別給予離體灌流大鼠心臟6.66(10-5 、6.66(10-4、6.66(10-3、6.66(10-2和0.67μg的UⅡ，心肌組織NOS活性由對照組的4.00±0.10分別增加為4.35±0.16、4.53±0.13、5.12±0.11、4.68±0.11和4.75±0.12nmol/min·mg-1protein。給予6.66(10-2μg 的UⅡ 5、10、15、30和45min后，NOS活性分別增加至4.78±0.13、5.15±0.20、5.34±0.12、4.85±0.16和4.54±0.12nmol/min·mg-1protein。L-NAME 30.6μg或Stau 5.29(10-5μg預(yù)處理20min再給予UⅡ，與UⅡ劑量為6.66(10-2μg組相比， 30min后NOS活性分別顯著降低3.28±0.19和3.56±0.16 nmol/min·mg-1protein；而SNP或PMA預(yù)處理后，NOS活性則均無顯著性變化。 5．分別給予離體灌流大鼠心臟6.66(10-5 、6.66(10-4、6.66(10-3、6.66(10-2和0.67μg的UⅡ30min，心肌eNOS含量分別增加（26.2±2.3）%、（55.8±4.8）%、（82.5±7.4）%、（96.2±7.8）%和（68.2±5.5）%；給予6.66(10-2μg 的UⅡ15、30和45min后，心肌eNOS含量分別增加（126.9±11.1）%、（96.2±7.8）%和WP=7（30.4±2.6）%。與UⅡ劑量為6.66(10-2μg組相比，30.6μg L-NAME或5.29(10-5μg Stau預(yù)處理20min后再給予UⅡ，eNOS含量分別下降至（39.4±3.5）%和（66.1±5.2）%；而SNP或PMA預(yù)處理后則對eNOS含量均無顯著性變化。 三、大鼠UⅡ?qū)π律笫笮募〖?xì)胞的促肥大作用及其機(jī)制 1．給予UⅡ10-7mol/L直至5d后，細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量才由對照的130±15μg/ml顯著增加至161±14μg/ml；分別給予10-10、10-9、10-8、10-7和10-6mol/L的UⅡ，光吸收度值可顯示細(xì)胞線粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶的活性從而反映
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R331.3
【圖文】：

同組織及心肌細(xì)胞總 RNA 凝膠電l electrophoresis analysis of total R：left ventricle；Lane2：left atrium：thoratic aorta；Lane4：carotid ao：cardiomyocytes泳分析次數(shù)的凝膠電泳分析-2）顯示在 30 次循環(huán)次數(shù)內(nèi)，PC PCR 產(chǎn)物在 30 次內(nèi)仍控制于指數(shù)

圖 1-2 不同循環(huán)次數(shù) β-actin PCR 產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)1-2 Agarose gel electrophoresis analysis of β -actiin different cyclesLane1：40 cycles；Lane2：35 cycles；Lane3：30 cLane4：25 cycles；Lane5：20 cycles；Lane6：15 cLane7：DNA marker (Gene rulerTM100 bp DNA lad010203015 20 25 30 35 40CycleselativeRD(%)O

顯示左心室表達(dá)豐度最高。見圖 1-4 和表 1-1。bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9圖1-4 心血管系統(tǒng) GPR14 mRNA表達(dá)的RT-PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig1-4 Agarose gel electrophoresis analysisof GPR14 mRNA in cardiovasculature systemLane1：β- actin (carotid aorta)；Lane2：GPR14 (carotid aorta)；Lane3：β- actin（thoratic aorta）；Lane4：GPR14（thoratic aorta）；Lane5：DNA marker；Lane6：β-actin(left atrium)；Lane7：GPR14 (left atrium)；Lane8：β- actin (left ventricle)；Lane9：GPR14 (left ventricle)904—356—

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本文編號(hào)：2798581