【摘要】： 目的：構(gòu)建截短的乙型肝炎表面抗原分子的原核和真核表達(dá)重組質(zhì)粒，然后分別在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)并純化表達(dá)蛋白及在真核細(xì)胞中表達(dá)目的基因，并檢測(cè)其抗原特性。為乙型肝炎的預(yù)防和治療性疫苗免疫原的選擇進(jìn)行初步的研究和探討。 方法：本研究利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，通過(guò)設(shè)計(jì)帶有不同酶切位點(diǎn)的一對(duì)引物，從質(zhì)粒pEcob6特異性擴(kuò)增HBsAg蛋白羧基末端152個(gè)氨基酸(S1)和124個(gè)氨基酸(S2)的基因片段，分別將二者克隆到質(zhì)粒pBKS(+)的多克隆位點(diǎn)，篩選重組克隆。將經(jīng)過(guò)PCR和雙酶切鑒定的重組克隆進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增的基因片段與擬擴(kuò)增目的基因序列完全一致。 運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，在pBKS-S1、pBKS-S2基礎(chǔ)上分別構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32a(+)-S1、pET32a(+)-S2；pQE30-S1、pQE30-S2(同時(shí)在已有的pBKS-S基礎(chǔ)上構(gòu)建了pET32a(+)-S、pQE30-S)和真核表達(dá)載體pCDNA3.1-S1、pCDNA3.1-S2、pCDNA3.1-S。用SDS-PAGE、Western blot、ELISA及免疫細(xì)胞組織化學(xué)等方法對(duì)原核、真核表達(dá)產(chǎn) 重慶醫(yī)科人學(xué)博l：學(xué)位論義 物進(jìn)行了檢測(cè)。 結(jié)果： 1．成功從質(zhì)粒pEcob6特異性擴(kuò)增了S1和S2的基因片段，分別 將二者克降到質(zhì)粒pBKS(+)，經(jīng)過(guò)PCR、雙酶切攀定、序列測(cè)定等 檢測(cè)。結(jié)果表明擴(kuò)增的基【大J片段與擬擴(kuò)增目的基因序列完全一致。 2．分別成功構(gòu)建‘』，原核表達(dá)載體pET32a(+)一S 1、pET32a(+)一S2： pQE30一S1、pQE30一S2及pET32a(+)一S、pQE30一S和真核表達(dá)載體 pCDNA3．1-S1、pCDNA3．1一S2、pCDNA3．1一S。 3．將原核表達(dá)載體pET32a(+)一S1、pET32a(+)一S2；pQE30．S1、 pQE30一S2在相應(yīng)表達(dá)宿主菌(BL21、SGl3009)中得到表達(dá)，表達(dá)量 可達(dá)菌體總蛋白的20％，其分子量與預(yù)計(jì)理論值相符合。而真核表達(dá) 載體pCDNA3．1一S1、pCDNA3．1一S2、pCDNA3．1一S則在不同真核細(xì)胞 (HepG：、COS一7)中得到表達(dá)。具體結(jié)果如下： 1)．S1基因能在細(xì)菌BL21(pET32a(+)一S1)、SGl3009(pQE30一 S1)和HepG2細(xì)胞(pCDNA3．1-S1)、COS一7細(xì)胞(pCDNA3．1一S1) 中表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物能被抗HBsAg a單克隆抗體識(shí)別。 2)．S2基因能在細(xì)菌BL21(pET32a(+)一S2)、SGl3009(pQE30一 S2)和HepG2細(xì)胞(pCDNA3．1-S2)、COS一7細(xì)胞(pCDNA3．1一S2) 中表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物能被抗HBsAg a單克隆抗體識(shí)別。 3)．S基因不能在細(xì)菌BL21(pET32a(+)一S)、SGl3009(pQE30一 S)中表達(dá)；而能在HepG2細(xì)胞(pCDNA3．1一S)、COS一7細(xì)胞 重慶醫(yī)科人學(xué)f啦I j學(xué)位論義 (pCDNA3．1一S)中表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物能被抗HBsAg a單克隆抗體識(shí) 刖。 結(jié)論：截短的乙型肝炎表面抗原分子的原核和真核表達(dá)’重組質(zhì)粒 成功被構(gòu)建及分別在人腸桿菌Efl得到誘導(dǎo)表達(dá)和存貞核細(xì)胞IfJ表達(dá)， 并檢測(cè)劍其表達(dá)產(chǎn)物的抗原特性。為乙型刖：炎的預(yù)防和治療性疫苗免 疫原的選擇進(jìn)行了成功的初步研究和探討。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類(lèi)號(hào)】：R392.1
【圖文】：

500250L.ILeC:51圖1一2Figl一2S1/SZPCR擴(kuò)增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖電泳1.0%agarosegeleleetroPhoresisofPCRProductsfromPEeob6重組克隆的酶切鑒定用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別酶切相應(yīng)的重組質(zhì)粒，能從重組質(zhì)粒上切下大小約300、500bp的片段。結(jié)果見(jiàn)圖l一3。A，D:enz卿edpB朽一51萬(wàn)，E:.n:卿edPB招一52500-200一LaneC:IkbGener飛遼ermarker圖1一3Figl一3重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物1.0%瓊脂糖電泳1.0%agarosegelelectroPhoresisofen盡medrecombinantPlasmids3.重組克隆的PCR鑒定以重組質(zhì)粒為模板，用相應(yīng)的引物，分別PCR擴(kuò)增51，52，能擴(kuò)增出大小約300、500bp的片段。結(jié)果見(jiàn)圖l一4。L81LeAL奴eB，L奴eC

C:enz卿edpQ助0一51LaneD，衛(wèi)，F(xiàn):enz，edpQE30一咫圖2一4重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物1.0%瓊脂糖電泳FigZ一41.0%agarosegelelectroPhoresisofen習(xí)medreeombinantPlasmids2)用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別酶切切下大小約700bp的片段。結(jié)果見(jiàn)圖S基因相應(yīng)的重組質(zhì)粒，能從重組質(zhì)粒上2一5。bP50003000750500L紅eA:IKBDNAmarkerL幼eB:enz卿edPBKS一SL心eC二enz物edpQE30一SL奴eD:enz卿edPET32a--S圖2一5F192一5重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物1.0%瓊脂糖電泳1.0%agarosegeleleetroPhoresisofen刃medreeombinantPlasmids35

LaneG:IkbGener，dermarkerS00圖2一3重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物1.0%瓊脂糖電泳FigZ一31.0%agarosegeleleetroPhoresisofen即medreeombinantPlasmidsABCDEFbP3000L吸.A:IkbGenerl眾er.arker500LaneB，C:enz卿edpQ助0一51LaneD，衛(wèi)，F(xiàn):enz，edpQE30一咫圖2一4重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物1.0%瓊脂糖電泳FigZ一41.0%agarosegelelectroPhoresisofen習(xí)medreeombinantPlasmids2)用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別酶切切下大小約700bp的片段。結(jié)果見(jiàn)圖S基因相應(yīng)的重組質(zhì)粒，能從重組質(zhì)粒上2一5。bP50003000750500L紅eA:IKBDNAmarkerL幼eB:enz卿edPBKS一SL心eC二enz物edpQE30一SL奴eD:enz卿edPET32a--S圖2一5F192一5重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物1.0%瓊脂糖電泳1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 房德興,李法卿,譚維國(guó),陳華標(biāo),金慧英,李素芹;乙型肝炎表面抗原124aa分子在大腸桿菌中的高效表達(dá)[J];免疫學(xué)雜志;1999年03期

2 任紅,TimHarrison;重組HBsAg免疫逃逸突變體的表達(dá)及其抗原性分析[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1996年02期

本文編號(hào)：2798395