【摘要】：大腸桿菌不耐熱腸毒素（heat-labile enterotoxin, LT）是一種能導(dǎo)致人畜腹瀉的 毒性因子，為產(chǎn)毒性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia, ETEC）產(chǎn)生的六聚體 蛋白。除了很強的毒性以外，LT 具有很強的免疫原性并且能夠輔佐其他抗原通過 粘膜免疫途徑使機體產(chǎn)生特異抗體，因而 LT，尤其是其無毒或低毒突變體，還是 良好的粘膜免疫佐劑，在粘膜免疫研究中以及粘膜免疫疫苗開發(fā)中具有重要醫(yī)學(xué) 價值和經(jīng)濟價值。另外，由于 LT 是由一個具有毒性的 A 亞單位（LTA）和形成環(huán) 狀的五個能夠與神經(jīng)節(jié)苷脂 GM1 結(jié)合而粘附于真核細(xì)胞膜上的 B 亞單位（LTB） 組成，結(jié)構(gòu)與功能都很復(fù)雜，不同位點的氨基酸突變會對其高級結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生 各不相同的影響，因而研究 LT 的突變體，不但可以篩選出可以應(yīng)用于臨床的侯選 粘膜免疫佐劑，而且還可拓寬我們對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識。 研究目的：獲得適應(yīng)中試規(guī)模生產(chǎn)、具較高表達(dá)效率的 LT 及 LT 的 B 亞單位 （LTB）表達(dá)系統(tǒng)。通過對 LT 的表達(dá)、純化及保存的方法進(jìn)行探索，尋找到 LT 優(yōu)化的表達(dá)、純化及保存方案。初步篩選出毒性較小、粘膜免疫佐劑活性較高的 LT 突變體，同時就氨基酸突變對 LT 結(jié)構(gòu)與功能的影響作一些理論探討。 研究方法：通過用改良的基因組提取方法從野生型產(chǎn)毒性大腸桿菌中提取到 lt 基因。利用基因工程技術(shù)將其重組于表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化宿主菌，在搖瓶中篩選優(yōu) 化的表達(dá)系統(tǒng)。改變 Immobilized D(+)-galactose 親和柱平衡緩沖液及目的蛋白洗脫 液的成分及 pH 值，優(yōu)化純化方案。通過對不同保存條件下的 LT 用 HPLC 作分子 篩層析判斷 LT 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性篩選出最佳保存方案。利用基因工程的定點突變技術(shù)， 構(gòu)建 LT 突變體。用在分子篩層析洗脫液中加入 1%SDS，觀察在洗脫過程中 A280nm 的區(qū)別判斷 LT 與突變體之間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的差異、從胰酶消化后 LTA 裂解出 LTA1 的多少判斷 LT 及突變體對胰酶的敏感性、用在中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞毒性檢 測中導(dǎo)致 CHO 細(xì)胞變形的劑量和程度及在 Patent-mouse 活體毒性檢測中導(dǎo)致腸內(nèi) 液體的多寡判斷 LT 及突變體的毒性。LT 突變體的粘膜免疫佐劑效應(yīng)由下述方法 進(jìn)行評價：將 LT 突變體作為幽門螺桿菌（Hp）尿素酶 B 亞單位（UreB）的佐劑， 口服免疫 BALB/c 小鼠，用 ELISA 法檢測血清及粘膜部位抗原特異的抗體水平、 用 ELISPOT 法觀察腸派伊爾結(jié)（PP 結(jié)）抗體分泌細(xì)胞、用 RT－PCR 法檢測細(xì)胞 因子的差別表達(dá)并與其他佐劑及疫苗進(jìn)行比較。 研究結(jié)果： 1、用改良基因組提取法從野生型產(chǎn)毒大腸桿菌中提取到含 lt 基因的質(zhì)粒。 2、 在生長于改良 M9－CAA 培養(yǎng)基的含 pET11c-LT 重組質(zhì)粒的 E.coli I WP=6 重慶大學(xué)博士學(xué)位論文 BL21(DE3)中以約 46mg/L 培養(yǎng)基的較高效率分泌表達(dá)出重組 LT。 3、 LT 在純化后馬上凍干并保存于 4℃可以長久保持其完整的六聚體結(jié)構(gòu)。該 法可避免 LT 以液態(tài)形式在緩沖液中 4℃或－70℃保存一定時間后發(fā)生解聚現(xiàn)象。 4、 構(gòu)建了 LTK63（第 63 位氨基酸由 S K），LTR72（第 72 位氨基酸由 A R） 和 LTKR（第 63、72 位氨基酸分別由 S、A 突變?yōu)?K、R）。 5、LTA2 結(jié)構(gòu)域內(nèi)的第 229、230、232、233 位的 4 個氨基酸由 E、V、I、Y 分別突變?yōu)榕c霍亂毒素該 4 個氨基酸相同的 D、I、T、H，命名為 LTDITH，同時 構(gòu)建了 LTK63，LTR72 和 LTKR 的相應(yīng)的 LTA2 結(jié)構(gòu)域突變體 LTKDITH、LTRDITH 和 LTKRDITH。另外還將 LTDITH 的第 232 位氨基酸突變?yōu)?Lys，命名為 LTDIKH。 6、 對重組 LT 及其突變體進(jìn)行了中試規(guī)模發(fā)酵并純化后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn) A2 結(jié)構(gòu)域 特定突變后的 LT，其表達(dá)效率大大提高，可達(dá) 160mg/L 培養(yǎng)基。 7、 用 HPLC 對野生 LT 及各種突變體進(jìn)行結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性檢測后， A2 結(jié)構(gòu)域特 定突變后的 LT 其穩(wěn)定性大大增加。相對于 LT，LTK63 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增加；LTR72 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低；LTKR 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增加。 8、 LTA2 結(jié)構(gòu)域特定突變后的 LT 的胰酶敏感性降低。LTK63、LTKR 比 rLT 及 LTR72 的胰酶敏感性降低。 9、 用 CHO 細(xì)胞毒性檢測實驗和 Patent-mouse 毒性檢測實驗表明，LTDITH 的毒性顯著低于 rLT。 10、 pET22b(+)-LTB/E.coli BL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)使 LTB 在 pelB 信號肽的引導(dǎo) 下既可分泌表達(dá)至胞周質(zhì)，也可使 LTB 以包含體形式存在。分泌表達(dá)的 LTB 能用 半乳糖親和柱一步純化出來，包含體形式存在的 LTB 能通過溶解、緩沖液置換后， 再用半乳糖親和柱純化，兩種方法純化的 LTB 具有相同的氨基酸組成并且具有正 常的免疫原性和 GM1 結(jié)合活性。 11、 LT 突變體及 LTB 在與 Hp 尿素酶 B 亞單位（UreB）通過口服途徑免疫 小鼠后具有明顯的佐劑效應(yīng)，血清 IgG、粘膜部位的 sIgA、PP 結(jié)抗體分泌細(xì)胞及 細(xì)胞因子如 IL-4、IFN-γ 的表達(dá)都明顯增加。 結(jié)論：改良的基因組提取方法是提取大質(zhì)粒的簡便方法。用 HPLC 結(jié)合分子 篩層析可以判斷 LT 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。LTK63 對 LT 六聚體的結(jié)構(gòu)還有明顯的影響。 LTDITH 及基于 LTDITH 的突變體能顯著改變 LT 的結(jié)構(gòu)與功能，即增加
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R346
【圖文】：

圖 1.1 B 亞單體與五聚體的二級結(jié)構(gòu)（引自 Sixma ematic secondary structure diagram of a single B subuni(From Sixma TK[4])后，單體被包埋的表面積為 2360 2，占單體體中發(fā)現(xiàn)的最大百分比[8]可能是五聚體穩(wěn)定性分為具有 ADP－核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的 A1 片段1 與 A2 之間借一個二硫鍵連接（A：187－199明顯的非球形結(jié)構(gòu)，以圖 1.3（引自 Williams N片段構(gòu)形復(fù)雜，包含有許多二級結(jié)構(gòu)，共計有 個殘基的 α 螺旋起始于殘基 200，該螺旋位于 A1 片段之間有許多相互作用，如范德瓦爾斯B（2）

LTA的二級結(jié)構(gòu)（引自SixmaTK[4]

圖 1.2 LTA 的二級結(jié)構(gòu)（引自 Sixma TK[4]）2 Schematic secondary structure diagram of A subunit(From N｜

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王越;胡明明;閻瑾琦;張亮;王宇;朱運峰;于繼云;;L1(ORF1)基因通過編碼和非編碼RNA表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響[J];軍事醫(yī)學(xué);2011年06期

2 李壯林;姚雪靜;于學(xué)珍;;人TNF-α突變體Y87H/A145R的表達(dá)及純化[J];中國醫(yī)藥工業(yè)雜志;2011年05期

3 韓艷輝;張_";康琳;高姍;辛文文;王景林;;重組蓖麻、相思子毒素A鏈嵌合突變體的制備與分析[J];生物技術(shù)通訊;2011年04期

4 張艷秋;李永軍;孫運波;邢金燕;王云龍;付正菊;;ApoA-I半胱氨酸突變體rHDL對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎影響[J];青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2011年04期

5 池宇朋;鄧梅春;吳遠(yuǎn)遠(yuǎn);羅吉;容明強;張亦雅;張東裔;曾雄智;梁宋平;;敬釗毒素-XI與突變體R3A-JZTX-XI的合成、復(fù)性及其藥理活性鑒定[J];生物工程學(xué)報;2011年06期

6 瞿少剛;張秀萍;;谷氨酸轉(zhuǎn)運體GLT-1的TM8區(qū)段在底物轉(zhuǎn)運過程中的功能分析[J];實用醫(yī)學(xué)雜志;2011年16期

7 聶詠鵬;陳偉華;;LDR法和實時熒光PCR法定量檢測慢性乙肝患者YMDD突變的比較[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2011年06期

8 楊帆;陳克終;姜冠潮;李劍鋒;王俊;;改良的內(nèi)切酶突變體富集法檢測肺癌標(biāo)本中EGFR基因突變[J];中國肺癌雜志;2011年08期

9 陳曉娟;楊宇東;孫莉;胡日查;邢雅玲;陳忠斌;;SARS冠狀病毒PLpro蛋白酶對泛素樣分子的DUB活性[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2011年07期

10 廖華;曾經(jīng)緯;張遠(yuǎn)恒;王新奪;童雪影;陳光慧;郭小梅;;Mfn2基因突變體誘導(dǎo)大鼠頸動脈球囊損傷后血管平滑肌細(xì)胞凋亡[J];臨床心血管病雜志;2011年07期

相關(guān)會議論文 前10條

1 周紅;王國力;黃培堂;黃翠芬;;組織型纖溶酶原激活劑新型突變體的分子設(shè)計及其生物活性的初步分析[A];面向21世紀(jì)的科技進(jìn)步與社會經(jīng)濟發(fā)展（上冊）[C];1999年

2 劉婧;張方;王寶山;陳凡;謝先芝;;水稻光敏色素B缺陷型突變體具有較強的干旱脅迫耐性[A];植物分子生物學(xué)與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)——全國植物生物學(xué)研討會論文摘要集[C];2010年

3 孫璐;文欣;譚英;李賀陽;趙月芳;牛聰偉;席真;;原卟啉原氧化酶及其突變體的酶學(xué)性質(zhì)研究[A];中國化學(xué)會第26屆學(xué)術(shù)年會化學(xué)生物分會場論文集[C];2008年

4 萬崎;章晚聯(lián);陳新文;;丙型肝炎病毒E2糖蛋白糖基化突變體的研究[A];中國蛋白質(zhì)組學(xué)首屆學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2003年

5 周靜;張國珍;彭友良;;稻瘟病菌一個菌落生長緩慢突變體的研究[A];中國植物病理學(xué)會2004年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2004年

6 金衛(wèi);;水稻長護(hù)穎突變體初步研究[A];全國作物生物技術(shù)與誘變技術(shù)學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2005年

7 朱傳鳳;吳家和;何朝族;;一個水稻半矮稈突變體的鑒定及其分子功能研究[A];全國植物分子育種研討會摘要集[C];2009年

8 張舒亞;周明國;李紅霞;;稻梨孢抗嘧菌酯突變體B9-R2的生物學(xué)性狀研究[A];2003’華東植物病理學(xué)術(shù)研討會暨江蘇省植物病理學(xué)會第十次會員代表大會論文集[C];2003年

9 王才林;趙凌;周壽芳;;廣親和eui水稻矮稈遲熟突變體“02428ha”的遺傳分析[A];中國的遺傳學(xué)研究——中國遺傳學(xué)會第七次代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編[C];2003年

10 戴新賓;張榮銑;許長成;匡廷云;;水稻葉綠素b減少突變體的光抑制特性研究[A];全國植物光合作用、光生物學(xué)及其相關(guān)的分子生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2001年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 李天舒;玉米中可提取抗艾物質(zhì)[N];健康報;2010年

2 記者　 龍軍;雜交稻種子鑒定找到新方法[N];光明日報;2006年

3 記者 朱興忠;甘州重離子束選育玉米新品種獲突破[N];張掖日報;2008年

4 江南雪舞;病毒“善變”[N];大眾衛(wèi)生報;2005年

5 胡必強邋記者 趙鳳華;我科學(xué)家發(fā)現(xiàn)水稻黃綠葉突變基因[N];科技日報;2007年

6 申淳;我國發(fā)現(xiàn)水稻黃綠葉突變基因[N];中國知識產(chǎn)權(quán)報;2007年

7 近物所;甘肅重離子輻照玉米誘變育種有新突破[N];農(nóng)資導(dǎo)報;2008年

8 安芬奇;我國育成膏桐新品種[N];中國綠色時報;2008年

9 劉舒 李安安;張啟發(fā)團(tuán)隊克隆出新基因[N];江蘇科技報;2008年

10 科綜;水稻“長生不老”可被制約[N];大眾科技報;2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 馮強;重組大腸桿菌不耐熱腸毒素及其突變體以及其B亞單位的構(gòu)建表達(dá)與性質(zhì)研究[D];重慶大學(xué);2003年

2 張樹梅;NP突變體抑制流感病毒復(fù)制的機制及形成流感病毒病毒樣顆粒的關(guān)鍵蛋白[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

3 田義新;擬南芥糖感知信號突變體mig3的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

4 趙淑娟;突變體黑羽鵪鶉的純化及其MHC class Ⅰ基因多態(tài)性與免疫功能關(guān)系研究[D];吉林大學(xué);2011年

5 藺潔;枯草溶菌素轉(zhuǎn)換酶9基因新突變的發(fā)現(xiàn)及其功能初步研究[D];南華大學(xué);2011年

6 楊在君;小麥三雌蕊突變體幼穗中基因的差異表達(dá)分析[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

7 劉堰;重組人白介素-2（IL—2）突變體克隆及在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá)與純化[D];重慶大學(xué);2002年

8 王金鳳;KGF-2結(jié)構(gòu)與功能的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

9 韓成云;擬南芥短日照依賴型模擬病斑SDL1基因的分離和功能分析[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

10 尹團(tuán)章;細(xì)胞周期基因過表達(dá)對油菜生長發(fā)育的影響和擬南芥種子發(fā)育必需基因ASD的功能分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 陳再冉;虎紋捕鳥蛛毒素-Ⅳ突變體K27A的化學(xué)合成與性質(zhì)以及兩種海南敬釗纓毛蛛毒素的結(jié)構(gòu)與功能研究[D];湖南師范大學(xué);2003年

2 王飛;甘薯類胡蘿卜素合成相關(guān)基因片段的克隆[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

3 孫嗣梅;蓖麻毒素A鏈及其突變體的表達(dá)、純化和分析[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

4 劉君紹;茄子抗黃萎�。╒erticillium wilt）突變體的離體篩選[D];西南農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

5 楊芳;水稻向地性突變體的生理研究、遺傳分析及相關(guān)基因的分子標(biāo)記定位[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

6 丁業(yè)掌;陸地棉兩個纖維突變體的遺傳以及纖維和短絨基因SSR標(biāo)記分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

7 宋景嬌;鹽沼鹽桿菌bop基因及啟動子的克隆及BR蛋白突變體的構(gòu)建和光致變色功能的研究[D];武漢大學(xué);2005年

8 霍華蕾;從山羊草中分離小麥籽粒硬度主效基因突變體的研究[D];華中科技大學(xué);2005年

9 齊興云;鹽芥ThTRXh蛋白的亞細(xì)胞定位及AtTRXh突變體的表型分析[D];山東師范大學(xué);2006年

10 殷亮;低分子量尿激酶與ATF-Fc融合蛋白的研究[D];吉林大學(xué);2006年

本文編號：2797571