【摘要】：大腸桿菌不耐熱腸毒素（heat-labile enterotoxin, LT）是一種能導致人畜腹瀉的 毒性因子，為產(chǎn)毒性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia, ETEC）產(chǎn)生的六聚體 蛋白。除了很強的毒性以外，LT 具有很強的免疫原性并且能夠輔佐其他抗原通過 粘膜免疫途徑使機體產(chǎn)生特異抗體，因而 LT，尤其是其無毒或低毒突變體，還是 良好的粘膜免疫佐劑，在粘膜免疫研究中以及粘膜免疫疫苗開發(fā)中具有重要醫(yī)學 價值和經(jīng)濟價值。另外，由于 LT 是由一個具有毒性的 A 亞單位（LTA）和形成環(huán) 狀的五個能夠與神經(jīng)節(jié)苷脂 GM1 結(jié)合而粘附于真核細胞膜上的 B 亞單位（LTB） 組成，結(jié)構(gòu)與功能都很復雜，不同位點的氨基酸突變會對其高級結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生 各不相同的影響，因而研究 LT 的突變體，不但可以篩選出可以應用于臨床的侯選 粘膜免疫佐劑，而且還可拓寬我們對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的認識。 研究目的：獲得適應中試規(guī)模生產(chǎn)、具較高表達效率的 LT 及 LT 的 B 亞單位 （LTB）表達系統(tǒng)。通過對 LT 的表達、純化及保存的方法進行探索，尋找到 LT 優(yōu)化的表達、純化及保存方案。初步篩選出毒性較小、粘膜免疫佐劑活性較高的 LT 突變體，同時就氨基酸突變對 LT 結(jié)構(gòu)與功能的影響作一些理論探討。 研究方法：通過用改良的基因組提取方法從野生型產(chǎn)毒性大腸桿菌中提取到 lt 基因。利用基因工程技術(shù)將其重組于表達載體中并轉(zhuǎn)化宿主菌，在搖瓶中篩選優(yōu) 化的表達系統(tǒng)。改變 Immobilized D(+)-galactose 親和柱平衡緩沖液及目的蛋白洗脫 液的成分及 pH 值，優(yōu)化純化方案。通過對不同保存條件下的 LT 用 HPLC 作分子 篩層析判斷 LT 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性篩選出最佳保存方案。利用基因工程的定點突變技術(shù)， 構(gòu)建 LT 突變體。用在分子篩層析洗脫液中加入 1%SDS，觀察在洗脫過程中 A280nm 的區(qū)別判斷 LT 與突變體之間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的差異、從胰酶消化后 LTA 裂解出 LTA1 的多少判斷 LT 及突變體對胰酶的敏感性、用在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞毒性檢 測中導致 CHO 細胞變形的劑量和程度及在 Patent-mouse 活體毒性檢測中導致腸內(nèi) 液體的多寡判斷 LT 及突變體的毒性。LT 突變體的粘膜免疫佐劑效應由下述方法 進行評價：將 LT 突變體作為幽門螺桿菌（Hp）尿素酶 B 亞單位（UreB）的佐劑， 口服免疫 BALB/c 小鼠，用 ELISA 法檢測血清及粘膜部位抗原特異的抗體水平、 用 ELISPOT 法觀察腸派伊爾結(jié)（PP 結(jié)）抗體分泌細胞、用 RT－PCR 法檢測細胞 因子的差別表達并與其他佐劑及疫苗進行比較。 研究結(jié)果： 1、用改良基因組提取法從野生型產(chǎn)毒大腸桿菌中提取到含 lt 基因的質(zhì)粒。 2、 在生長于改良 M9－CAA 培養(yǎng)基的含 pET11c-LT 重組質(zhì)粒的 E.coli I WP=6 重慶大學博士學位論文 BL21(DE3)中以約 46mg/L 培養(yǎng)基的較高效率分泌表達出重組 LT。 3、 LT 在純化后馬上凍干并保存于 4℃可以長久保持其完整的六聚體結(jié)構(gòu)。該 法可避免 LT 以液態(tài)形式在緩沖液中 4℃或－70℃保存一定時間后發(fā)生解聚現(xiàn)象。 4、 構(gòu)建了 LTK63（第 63 位氨基酸由 S K），LTR72（第 72 位氨基酸由 A R） 和 LTKR（第 63、72 位氨基酸分別由 S、A 突變?yōu)?K、R）。 5、LTA2 結(jié)構(gòu)域內(nèi)的第 229、230、232、233 位的 4 個氨基酸由 E、V、I、Y 分別突變?yōu)榕c霍亂毒素該 4 個氨基酸相同的 D、I、T、H，命名為 LTDITH，同時 構(gòu)建了 LTK63，LTR72 和 LTKR 的相應的 LTA2 結(jié)構(gòu)域突變體 LTKDITH、LTRDITH 和 LTKRDITH。另外還將 LTDITH 的第 232 位氨基酸突變?yōu)?Lys，命名為 LTDIKH。 6、 對重組 LT 及其突變體進行了中試規(guī)模發(fā)酵并純化后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn) A2 結(jié)構(gòu)域 特定突變后的 LT，其表達效率大大提高，可達 160mg/L 培養(yǎng)基。 7、 用 HPLC 對野生 LT 及各種突變體進行結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性檢測后， A2 結(jié)構(gòu)域特 定突變后的 LT 其穩(wěn)定性大大增加。相對于 LT，LTK63 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增加；LTR72 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低；LTKR 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增加。 8、 LTA2 結(jié)構(gòu)域特定突變后的 LT 的胰酶敏感性降低。LTK63、LTKR 比 rLT 及 LTR72 的胰酶敏感性降低。 9、 用 CHO 細胞毒性檢測實驗和 Patent-mouse 毒性檢測實驗表明，LTDITH 的毒性顯著低于 rLT。 10、 pET22b(+)-LTB/E.coli BL21(DE3)表達系統(tǒng)使 LTB 在 pelB 信號肽的引導 下既可分泌表達至胞周質(zhì)，也可使 LTB 以包含體形式存在。分泌表達的 LTB 能用 半乳糖親和柱一步純化出來，包含體形式存在的 LTB 能通過溶解、緩沖液置換后， 再用半乳糖親和柱純化，兩種方法純化的 LTB 具有相同的氨基酸組成并且具有正 常的免疫原性和 GM1 結(jié)合活性。 11、 LT 突變體及 LTB 在與 Hp 尿素酶 B 亞單位（UreB）通過口服途徑免疫 小鼠后具有明顯的佐劑效應，血清 IgG、粘膜部位的 sIgA、PP 結(jié)抗體分泌細胞及 細胞因子如 IL-4、IFN-γ 的表達都明顯增加。 結(jié)論：改良的基因組提取方法是提取大質(zhì)粒的簡便方法。用 HPLC 結(jié)合分子 篩層析可以判斷 LT 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。LTK63 對 LT 六聚體的結(jié)構(gòu)還有明顯的影響。 LTDITH 及基于 LTDITH 的突變體能顯著改變 LT 的結(jié)構(gòu)與功能，即增加
【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R346
【圖文】：

圖 1.1 B 亞單體與五聚體的二級結(jié)構(gòu)（引自 Sixma ematic secondary structure diagram of a single B subuni(From Sixma TK[4])后，單體被包埋的表面積為 2360 2，占單體體中發(fā)現(xiàn)的最大百分比[8]可能是五聚體穩(wěn)定性分為具有 ADP－核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的 A1 片段1 與 A2 之間借一個二硫鍵連接（A：187－199明顯的非球形結(jié)構(gòu)，以圖 1.3（引自 Williams N片段構(gòu)形復雜，包含有許多二級結(jié)構(gòu)，共計有 個殘基的 α 螺旋起始于殘基 200，該螺旋位于 A1 片段之間有許多相互作用，如范德瓦爾斯B（2）

LTA的二級結(jié)構(gòu)（引自SixmaTK[4]

圖 1.2 LTA 的二級結(jié)構(gòu)（引自 Sixma TK[4]）2 Schematic secondary structure diagram of A subunit(From N｜

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本文編號：2797571