發(fā)布時(shí)間：2020-08-19 20:14

【摘要】： 瘧原蟲(chóng)是在脊椎動(dòng)物和媒介昆蟲(chóng)蚊之間循環(huán)傳播的，配子體是連接兩者使其完成生活史的唯一發(fā)育階段，而雄配子體在蚊胃腔內(nèi)的出絲現(xiàn)象則是瘧原蟲(chóng)經(jīng)蚊傳播的重要環(huán)節(jié)。已有報(bào)道表明，環(huán)境溫度降低和pH升高(從哺乳動(dòng)物血液pH升至8.0)誘導(dǎo)體外雄配子發(fā)生。然而，蚊吸血后其胃內(nèi)容物的pH并未超過(guò)7.8，即體外誘導(dǎo)雄配子體出絲的臨界pH值，因此必有其它因素存在于吸血后的蚊胃內(nèi)容物中誘導(dǎo)雄配子發(fā)生。已有學(xué)者分別從斯氏按蚊(Anopheles stephensi)蛹和成蟲(chóng)頭部純化出這種配子發(fā)生激活因子(gametocyte activating factor，GAF)，并鑒定其化學(xué)成分為黃尿酸(xanthurenic acid，XA)。XA是色氨酸分解代謝旁路產(chǎn)物之一，主要分布于昆蟲(chóng)成蟲(chóng)的頭、眼部，其存在與昆蟲(chóng)眼及翅的顏色形成有關(guān)。 為探索蚊體內(nèi)GAF的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以“按蚊唾液腺內(nèi)含有GAF，吸血時(shí)與唾液、血液一同返流至胃腔，并誘導(dǎo)雄配子發(fā)生”為命題，進(jìn)行了以下研究：(1)應(yīng)用體外雄配子體出絲觀察及其它相關(guān)方法，首次對(duì)斯氏按蚊唾液腺抽提物和勻漿上清中的GAF進(jìn)行了分析，以期闡明按蚊唾液腺GAF在哺乳動(dòng)物瘧原蟲(chóng)傳播過(guò)程中的作用機(jī)制；(2)對(duì)斯氏按蚊、大森按蚊(An.omorii)、中華按蚊(An.sinensis)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、白紋伊蚊(Ae.albopictus)和淡色庫(kù)蚊(Culex pipiens pallens)等3屬6種蚊唾液腺抽提物的GAF活性及其中5個(gè)蚊種雌蚊唾液腺抽提物GAF活性在吸血前后的變化進(jìn)行了比較分析，以期闡明按蚊屬媒介昆蟲(chóng)在哺乳動(dòng)物瘧疾傳播中的作用；(3)選取羽化后不同蚊齡、吸血前后不同蚊齡、產(chǎn)卵前后不同蚊齡的雌性斯氏按蚊唾液腺和卵巢為模型器官，對(duì)2種器官中GAF和總蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了分析，以期闡明按蚊唾液腺中GAF的活性動(dòng)態(tài)與蚊卵產(chǎn)出的關(guān)系。 材料和方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1．嚙齒動(dòng)物瘧原蟲(chóng)：柏氏瘧原蟲(chóng)由日本自治醫(yī)科大學(xué)醫(yī)動(dòng)物學(xué)教室 經(jīng)BALB／c小鼠和斯氏按蚊循環(huán)保種。凍存復(fù)蘇的柏氏瘧原蟲(chóng)經(jīng)腹腔接種 BALB止 ／J＼鼠，感染后第 10～12天采小鼠尾靜脈血用于雄配子體出絲觀 察。 2．媒介昆蟲(chóng)：斯氏按蚊、大森按蚊、埃及伊蚊、白紋伊蚊和淡色庫(kù) 蚊均由日本自治醫(yī)科大學(xué)醫(yī)動(dòng)物學(xué)教室保存并傳代飼養(yǎng)。中華按蚊幼蟲(chóng) 采自日本楊木縣河內(nèi)郡南河內(nèi)叮自治醫(yī)科大學(xué)周邊地區(qū)，由同實(shí)驗(yàn)室飼 養(yǎng)至成蟲(chóng)。 3．小鼠：雌性 BALB業(yè)和 ICR小鼠購(gòu)于日本 SLC公司。 主要試劑及儀器設(shè)備 由日本自治醫(yī)科大學(xué)醫(yī)動(dòng)物學(xué)教室提供。 實(shí)驗(yàn)方法 1．雌蚊吸血實(shí)驗(yàn) 吸血前6h停止喂飼果糖溶液，吸食小鼠血液30～60min，留取血食 充分的蚊繼續(xù)飼養(yǎng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需收集吸血前后不同蚊種各時(shí)相點(diǎn)唾液 腺及其它相關(guān)器官。 2．唾液腺收集及抽提物制備 首先將不同種蚊置于《0℃冷凍麻痹，在立體解剖顯微鏡下解剖蚊體， 將完整的唾液腺洗滌后立即置入含有 100HI培養(yǎng)液的 Eppendorf管中，再 次離心洗滌后奔除上清，將含有唾液腺沉淀的離心管置于二0℃和室溫凍 融各3次，最后將抽提物置于上0℃保存。 3．斯氏按蚊頭、唾液腺及卵巢勻漿上清制備 按上述方法解剖按蚊，收集蚊頭、唾液腺和卵巢。將完整的頭、唾液 腺及卵巢立即分別置入含有 100pl RPMI 1640（PH 7．二）的 Eppendorf管中， 冷凍并在冰浴上制成勻漿后 5000 pm離心 smin，棄除沉淀，最后將上清 置于上0 OC保存。 4．體外雄配于體出絲觀察 所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在 ZI oC條件下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前按實(shí)驗(yàn)所需濃度以 RPMI －2－ 1640稀釋待測(cè)樣品至工作濃度，抽取 0．spl柏氏瘧原蟲(chóng)感染的 BALB／C ’J’鼠尾尖血液，在雙孔親水玻片上與 5 pl樣品溶液混合，加蓋片孵化 15min，光學(xué)顯微鏡下觀察出絲運(yùn)動(dòng)中心，10x40倍率記數(shù) 10個(gè)視野， 每組樣品至少重復(fù) 3次實(shí)驗(yàn)，以 RPMll 640，pH 8對(duì)條件下所獲出絲運(yùn)動(dòng) 中心數(shù)的百分率均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示GAF活性。 5．斯氏按蚊頭、唾液腺及卵巢總蛋白含量測(cè)定 按前述方法收集蚊頭、唾液腺和卵巢，分別置入含有 100VI PBS的 Eppendorf管中，制成勻漿并稀釋成工作濃度。蛋白測(cè)定在96孔酶標(biāo)板上 進(jìn)行，每孔反應(yīng)體積為 200…，ELISA檢測(cè)儀測(cè)量 595urn OD值，根據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)曲線計(jì)算總蛋白含量。 6．斯氏按蚊分組 （1）未吸血組：分另于羽化后當(dāng)天，第 2、4、6、8。10。12和 I4 天解剖蚊體；Q）吸血后未產(chǎn)卵組：羽化后第6天吸食小鼠血，留取血 食充分的按蚊繼續(xù)飼養(yǎng)。分別于吸血前當(dāng)天、吸血后lh內(nèi)、吸血后第2、 4、6和8天解剖蚊體；臼）吸血后產(chǎn)卵組：按吸血后未產(chǎn)卵組處理方法 讓按蚊吸血，吸血后第3天允許按蚊產(chǎn)卵。吸血后第4天（產(chǎn)卵翌日） 至第8天，檢查按蚊產(chǎn)卵情況，選用己完成產(chǎn)卵的按蚊，與未產(chǎn)卵組相 同各時(shí)相點(diǎn)解剖蚊體。 7．聚丙烯酸胺凝膠電泳分析 按前述方法在各時(shí)相點(diǎn)分別收集按蚊唾液腺。將樣品置于PBSu對(duì) 唾液腺八0…PBS人上0℃保存。實(shí)驗(yàn)前于室溫融解唾液腺樣品，加匕… 樣品緩沖液混?
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R382
【圖文】：

瘧疾流行范圍仍然分布于全國(guó)18個(gè)省、市、自治區(qū)，受威脅人口達(dá)5.3億，是目前高發(fā)的感染性疾病之一。人體瘧原蟲(chóng)生活史較為復(fù)雜，需要人和按蚊二個(gè)宿主(圖1一1)。在人體先后寄生于肝細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行裂體增殖。在紅細(xì)胞內(nèi)，除進(jìn)行裂體增殖外，尚可形成配子體，開(kāi)始有性生殖的初期發(fā)育。當(dāng)雌性按蚊刺吸病人或帶蟲(chóng)者血液時(shí)，在紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)育的各期原蟲(chóng)隨血液進(jìn)入蚊胃，僅雌、雄配子體繼續(xù)發(fā)育，其余各期原蟲(chóng)均被消化。其中雄配子體進(jìn)行快速的DNA合成，隨即核分裂成4~8塊，細(xì)胞質(zhì)則伸出4一8條鞭毛狀細(xì)絲，然后每一小塊核進(jìn)入一條細(xì)絲中

Sinden)a:salivarygland;b:lumenofmidgut;e:exflagellation.圖1一3柏氏瘧原蟲(chóng)雄配子體出絲a:雄配子體:b:鞭毛狀細(xì)絲;c:瘧原蟲(chóng)寄生的紅細(xì)胞Fig.1一3ExflagellationofPlasmodiumbergheia:mierogametoeyte:b:flagellum一likesubstance;e:尸Z“，modiumParasite一Parasitizedery’thr0eytentlee勺‘

嘛圖1一2瘧原蟲(chóng)在蚊體內(nèi)的發(fā)育a:唾液腺;b:胃腔;c:雄配子體出絲Fig.1一2ThemalariaParasitedeveloPmeniinmosquito(RF.BillingsleyandR.E.Sinden)a:salivarygland;b:lumenofmidgut;e:exflagellation.圖1一3柏氏瘧原蟲(chóng)雄配子體出絲a:雄配子體:b:鞭毛狀細(xì)絲;c:瘧原蟲(chóng)寄生的紅細(xì)胞Fig.1一3ExflagellationofPlasmodiumbergheia:mierogametoeyte:b:flagellum一likesubstance;e:尸Z“，modiumParasite一Parasitizedery’thr0eytentlee勺‘

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 馬冬瑩;賴仞;阮英強(qiáng);;昆蟲(chóng)活性物質(zhì)的免疫調(diào)節(jié)作用[A];云南省昆蟲(chóng)學(xué)會(huì)2009年年會(huì)論文集[C];2009年

本文編號(hào)：2797534