【摘要】： 本文構(gòu)建了一種以組蛋白H10為骨架，靶向于表皮生長因子（EGF）受體的新型基因?qū)胂到y(tǒng)。其創(chuàng)新性在于，把基因?qū)胂到y(tǒng)中的各種功能成分組建成為融合基因，在大腸桿菌中表達(dá)，是化學(xué)合成基因?qū)胂到y(tǒng)的延續(xù)，屬相關(guān)領(lǐng)域的首次嘗試與報道。 在以往的研究中，我們構(gòu)建了多聚賴氨酸（polylysine）為骨架、靶向于EGF受體的基因?qū)胂到y(tǒng)。GE7-polylysine和HA20-polylysine是系統(tǒng)的兩個組成成分。GE7是一種化學(xué)合成的16肽，靶向于EGF受體。HA20來源于流感病毒血凝素蛋白，是內(nèi)吞小體釋放寡肽。功能肽GE7、HA20分別通過化學(xué)交聯(lián)與polylysine連接。在體內(nèi)、體外導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)中，這種polylysine為骨架的基因?qū)胂到y(tǒng)能夠靶向性地將DNA導(dǎo)入EGF受體高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。但化學(xué)交聯(lián)很難確定與polylysine連接的寡肽數(shù)目并且花費(fèi)昂貴，限制了進(jìn)一步的應(yīng)用�；蚬こ谭椒芙鉀Q這些問題，但在大腸桿菌體內(nèi)不可能表達(dá)polylysine，因此我們設(shè)計(jì)了組蛋白H10為骨架的基因?qū)胂到y(tǒng)。我們總共構(gòu)建了九種融合蛋白，它們分別為GE7-histone-HA20, GE7-histone97-193-HA20, HA20-histone-GE7, Histone-GE7, Histone-HA20, Histone97-193-GE7, Histone97-193-HA20， Histone，Histone97-193。Histone和Histone97-193兩種蛋白作為陰性對照。 組蛋白H10和組蛋白H1097-193通過PCR從人胎盤cDNA文庫中獲得。與組蛋白H10或組蛋白H1097-193連接的GE7和HA20是從本人構(gòu)建的表達(dá)序列GE7-protamine和HA20-protamine中PCR獲得。通過一系列重疊的引物，數(shù)輪PCR"搭橋"反應(yīng)最終獲得九個融合蛋白的表達(dá)序列。所有的表達(dá)序列均克隆在pT7450原核表達(dá)載體中。 WP=5 融合蛋白的表達(dá)宿主菌是HMS174（DE3），表達(dá)產(chǎn)物通過SP Sepharose和Sephadex G-50純化。 所有的融合蛋白與質(zhì)粒DNA混合后，都能阻滯DNA在1%瓊脂糖凝膠中的遷移，電泳結(jié)果表明融合蛋白具有結(jié)合DNA的能力。DNA與蛋白結(jié)合的最佳質(zhì)量比為1:3。我們采用了經(jīng)免疫組化鑒定表達(dá)EGF受體的SKOV3裸鼠皮下移植瘤、BEL-7402細(xì)胞株、BEL-7402裸鼠皮下移植瘤作為靶細(xì)胞、組織以檢測融合蛋白的生物學(xué)活性。U2OS細(xì)胞表面未檢測出EGF受體的表達(dá)，作為導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)的陰性對照。體外導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)表明，只有2種蛋白組合（GE7-histone-HA20/Histone-GE7, Histone-GE7/Histone- HA20）能將(-gal基因?qū)氡磉_(dá)EGF受體的細(xì)胞，其他組合或單獨(dú)的蛋白均不能將DNA靶向性地導(dǎo)入EGF受體高表達(dá)的細(xì)胞。體內(nèi)導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)表明，未連接GE7或HA20的組蛋白不能將DNA靶向性地導(dǎo)入細(xì)胞，單獨(dú)Histone-HA20也是同樣的結(jié)果；單獨(dú)的Histone-GE7，GE7-histone-HA20，HA20-histone-GE7組的腫瘤中僅檢測出少量(-gal基因的表達(dá)；將Histone-GE7和Histone-HA20等量混合后，(-gal基因的表達(dá)有所增加；GE7-histone-HA20和Histone-GE7等量混合后，SKOV3和BEL-7402腫瘤中可檢測到大量(-gal基因的表達(dá)。體外導(dǎo)入篩選實(shí)驗(yàn)表明，Histone97-193為骨架的基因?qū)胂到y(tǒng)活性不如Histone全長。GE7-histone-HA20/Histone-GE7蛋白組合是經(jīng)體內(nèi)外導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)篩選獲得的最佳基因?qū)胂到y(tǒng)。 我們同時研究了GE7-histone-HA20/Histone-GE7蛋白組合介導(dǎo)的(-gal基因在腫瘤組織中的表達(dá)隨時間推移的變化：在皮下瘤周注射后12小時，就有(-gal基因的表達(dá)，24小時表達(dá)達(dá)到高峰，48小時開始下降，96小時、7天、10天表達(dá)繼續(xù)下降，2周后腫瘤組織內(nèi)仍有少量(-gal基因表達(dá)。腫瘤組織中導(dǎo)入的(-gal基因的表達(dá)水平還隨復(fù)合體劑量的增加而上升。含DNA 1(g的復(fù)合體是皮下瘤周注射的最佳劑量。 這一設(shè)計(jì)思路將基因?qū)胂到y(tǒng)中各種功能成分連接后通過基因工程方法表達(dá)，屬首次嘗試與報道，因此僅僅是一個起點(diǎn)。由于給藥后，復(fù)合體顆粒要?dú)v經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外的重重障礙，才能到達(dá)靶細(xì)胞核，在整個過程中，有眾多干擾因素阻礙著復(fù)合體的導(dǎo)入進(jìn)程，增加復(fù)合體顆粒的穩(wěn)定性，避免被降解是該研究今后的發(fā)展方向。通過聚乙二醇化可使DNA與融合蛋白形成的復(fù)合體穩(wěn)定性增加。這是在顆粒進(jìn)入靶細(xì)胞前，維持穩(wěn)定不被降解的對策。通過對復(fù)合體顆粒的修飾，完善基因?qū)胂到y(tǒng)，以排除細(xì)胞內(nèi)外的干擾，將為今后的臨床基因治療奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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1 田培坤,任圣俊,任常春,滕青山,曲淑敏,姚明,顧健人;一種新的以細(xì)胞表面受體為靶向的基因?qū)胂到y(tǒng)[J];中國科學(xué)C輯:生命科學(xué);1998年06期

本文編號：2796526