【摘要】：當(dāng)機(jī)體受到病毒感染時,免疫細(xì)胞將通過模式識別受體識別病毒成分并活化下游的信號通路,從而表達(dá)I型干擾素(Interferon, IFN)和促炎癥細(xì)胞因子。其中,I型干擾素在激發(fā)抗病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用,并且其表達(dá)受機(jī)體精確調(diào)控,而病毒本身也能干預(yù)抗病毒信號通路,實現(xiàn)其對機(jī)體抗病毒天然免疫的逃逸進(jìn)而增強(qiáng)自身的復(fù)制。病毒干預(yù)和逃逸機(jī)體抗病毒天然免疫應(yīng)答的機(jī)制是天然免疫研究的重大科學(xué)問題。此外,miRNA在天然免疫應(yīng)答的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用,病毒在miRNA層面與機(jī)體的相互作用和機(jī)制目前受廣泛關(guān)注。據(jù)此,本研究擬通過探求在病毒感染過程中胞內(nèi)表達(dá)改變的miRNA并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制,以尋求病毒通過調(diào)控機(jī)體miRNA的表達(dá)進(jìn)而干預(yù)抗病毒天然免疫應(yīng)答和實現(xiàn)免疫逃逸的分子機(jī)制。我們先期通過高通量miRNA芯片篩選,發(fā)現(xiàn)在RNA病毒VSV感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的過程中,miR-27a的表達(dá)顯著降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),miR-27a的表達(dá)受到IFN/JAK/STAT1信號通路的調(diào)控,并且依賴于RUNX1蛋白。miR-27a的表達(dá)下調(diào)將顯著抑制病毒誘導(dǎo)的I型干擾素產(chǎn)生進(jìn)而增強(qiáng)病毒自身的復(fù)制。在分子機(jī)制研究中,通過小鼠全基因組表達(dá)譜芯片發(fā)現(xiàn),miR-27a能夠靶向作用于唾液酸凝集素受體Siglecl和TRIM家族的E3泛素化連接酶TRIM27,過表達(dá)miR-27a后能在mRNA和蛋白水平上降低Siglecl和TRIM27的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Siglecl能與DAP12相互作用,進(jìn)而活化酪氨酸磷酸酶SHP2,活化的SHP2能招募E3泛素化連接酶TRIM27后作用于TBK1,使TBK1上251位和372位的賴氨酸殘基發(fā)生K48位連接的泛素化修飾進(jìn)而促進(jìn)其在蛋白酶體中降解,最終導(dǎo)致負(fù)向調(diào)控I型干擾素的表達(dá)。我們構(gòu)建了miR-27a-sponge的轉(zhuǎn)基因小鼠,在體內(nèi)進(jìn)一步驗證miR-27a的功能,當(dāng)腹腔注射VSV后,與對照組相比,miR-27a-sponge小鼠血清中的IFN-β的表達(dá)量顯著降低,HE染色發(fā)現(xiàn),小鼠肺臟中炎癥細(xì)胞浸潤更明顯,肝、脾、肺中VSV病毒的復(fù)制更強(qiáng)。由此,我們證明了病毒感染誘導(dǎo)表達(dá)下調(diào)的miR-27a能靶向增強(qiáng)負(fù)調(diào)控因子Siglecl和TRIM27的表達(dá),促進(jìn)TBK1的降解,進(jìn)而反饋抑制I型干擾素的表達(dá)和增強(qiáng)病毒自身的復(fù)制,即病毒利用miR-27a來實現(xiàn)自身的免疫逃逸,因此我們發(fā)現(xiàn)了一種病毒逃逸抗病毒天然免疫的新機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【圖文】：

然而，病毒誘導(dǎo)下調(diào)的ｍｉＲ－２７ａ在抗病毒天然免疫應(yīng)答中的功能仍然未知。逡逑我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ＶＳＶ感染巨噓細(xì)胞后ｍｉＲ－２７ａ表達(dá)依賴于ＶＳＶ刺激的劑量逡逑和時間，并且在ＭＯＩ值為１時或ＶＳＶ感染后２４ｈ達(dá)到最低值（圖３．１ａ）。在ＲＮＡ逡逑滴毒ＳｅＶ感染后，同樣在巨噓細(xì)胞中下調(diào)ｍｉＲ－２７ａ的表達(dá)（圖３．化）。逡逑巧逡逑２邋１－５＾邐２邋１．５－逡逑Ｃ邐Ｃ逡逑｜１。－曲邐｜ｌ．。－瞧逡逑Ｉ邋國‘邐｜｜Ａ逡逑｜：ｌｌｌｗ邋ｉｌｌｌｌｌｍｉ逡逑Ｇ邋＾邐盡邋Ｅ邋Ｏｈ邋６ｈ邋８ｈ１２ｈ２４ｈ３６ｈ逡逑。ＶＳＶ邋ＭＯＩ邐ＶＳＶ逡逑ｂ逡逑｜ｌ－５－逡逑ｌｌ．Ｏ邋＊邋＾邐１１．０－曲逡逑ｉｌｌｌｌｌｌｌ邋ｉｌｌｌｉｌｌｔｌ逡逑Ｅ邋＇邐0０、0、0＞、令邋Ｓ＇邋Ｏｈ邋４ｈ邋６ｈ１２ｈ２４ｈ３６ｈ逡逑0邋ＳｅＶ邋ＭＯＩ邐ＳｅＶ逡逑圖３．１病毒感染顯著下調(diào)小款腹膛巨嗤細(xì)胞中ｍ瓜－２７ａ的表達(dá)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．１邋Ｖｉｒａｌ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｓｉｇｎｉｆｃａｎｔｌｙ邋ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓ邋ｍｉＲ－２７ａ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．邋（ａ，ｂ）逡逑Ｑ－ＰＣ民邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｍｉ民－２７ａ邋ｉｎ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｐｅｒｋｏ打ｅａｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｉｎｆｅｃｔ；ｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＶＳＶ邋（ａ）逡逑ｏｒ邋ＳｅＶ邋（ｂ）邋ｆｏｒ邋２４邋ｈ：邋ｏｒ邋ｉｎ托ｃｔｅｄ邋ｗｉ化邋ＶＳＶ邋（ａ）邋ｏｒ邋ＳｅＶ邋（ｂ）邋ａｔ邋ａｎ邋ＭＯＩ＝ｌ邋ｆｏｒ邋化ｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｄ逡逑ｔｉｍｅ

圖３．６邋ｍｉＲ－２７ａ不能直接X1向于ＶＳＶ的ＲＮＡ邐ｉｕ化邋３．６邋ｍｉＲ－２７ａ邋ｄｏｅｓ邋ｎｏｔ邋ｄｉｒｅｃｔｌｔａｒｅｔ邋ＶＳＶ邋ＲＮＡｓ．－ＰＣ民邋ａｎａｌｓｉｓ邋ｏｆ邋ＶＳＶ邐

長ＴＲＩＭ２７相互巧時，也同樣發(fā)現(xiàn)只有含Ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ結(jié)構(gòu)域截短體才能與ＴＲＩＭ２７逡逑相互結(jié)合，這證明ＴＲＩＭ２７－ＴＢＫ１之間的結(jié)合是依賴于它們各自的Ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ結(jié)構(gòu)逡逑域（圖３．１６ａ，ｂ），這與Ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ結(jié)構(gòu)域的功能是一致的，據(jù)報道該結(jié)構(gòu)域能引逡逑起同源和異源蛋白之間的相互作用，從而形成二聚體或蛋白質(zhì)的復(fù)合物。同時我逡逑們也發(fā)現(xiàn)

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