【摘要】： 目的：將蜂毒素基因置于CMV(cytomegalovirus)啟動子和AFP(α-fetoprotein)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(rAFP)驅(qū)動下，構(gòu)建重組腺病毒載體，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)基因抑瘤實(shí)驗(yàn)，并觀察蜂毒素基因轉(zhuǎn)染對肝癌細(xì)胞惡性度的影響。 方法：人工合成蜂毒素基因，用Kozak序列優(yōu)化翻譯起始區(qū)，并進(jìn)行人類最適密碼子的轉(zhuǎn)換，然后置于CMV啟動子或rAFP之后，用細(xì)菌內(nèi)高效同源重組法將目的基因重組入腺病毒質(zhì)粒中；將腺病毒質(zhì)粒用Pac Ⅰ酶切線性化后，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行腺病毒的包裝。攜有蜂毒素基因的腺病毒感染肝癌細(xì)胞后，RT-PCR實(shí)驗(yàn)觀察蜂毒素基因是否發(fā)生轉(zhuǎn)錄；采用MTT法和~3H-TdR摻入法測定蜂毒素基因轉(zhuǎn)染對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用；采用ELISA雙抗體夾心法定量檢測甲胎蛋白，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD54表達(dá)情況，以觀察蜂毒素基因轉(zhuǎn)染對肝癌細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響。并以CMV啟動子作為對照，觀察在rAFP驅(qū)動下，蜂毒素基因轉(zhuǎn)染能否特異性地抑制AFP陽性細(xì)胞的增殖。 結(jié)果：攜蜂毒素基因的重組腺病毒載體構(gòu)建成功，RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明蜂毒素基因可以得到轉(zhuǎn)錄。MTT與~3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞在感染腺病毒后，其增殖率在前48小時(shí)的變化主要是受病毒本身的作用，而非目的基因的作用，特點(diǎn)是低滴度時(shí)抑制細(xì)胞的生長，高滴度時(shí)則刺激細(xì)胞的增殖。第72小時(shí)，病毒本身的作用基本消失，蜂毒素基因的作用凸現(xiàn)出來，表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，且抑制效應(yīng)與病毒滴度的對數(shù)呈正相關(guān)，可以認(rèn)為是蜂毒素基因被轉(zhuǎn)錄翻譯所起的作用。ELISA法檢測甲胎蛋白表明蜂毒素基因轉(zhuǎn)染可以降低AFP的生成量，流 式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，蜂毒素基因轉(zhuǎn)染可以抑制 CD54分子的表達(dá)。不同 啟動子作用的比較表明，蜂毒素基因在rAFP的控制下，可以特異性地 古制AFPF性肝癌細(xì)胞64增殖。 結(jié)論：蜂毒素基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，不僅可以得到轉(zhuǎn)錄和翻譯，且其作 用也足以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，證明 通過轉(zhuǎn)蜂毒素基因的方法可以起到抗腫瘤的作用。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2795199