【摘要】：脂多糖是革蘭氏陰性細菌主要的表面成分，由內到外包括類脂A、核心多糖和O-抗原。O-抗原是細菌細胞最主要的表面抗原，為由重復的寡糖單位組成的多聚糖，每一種細菌都有種類不同的O-抗原存在，形成了自然界中最為突出的生物多樣性，編碼合成這些多糖的酶的基因簇成為在DNA水平上研究分子進化的最好的材料。O-抗原的多樣性對細菌在人或動物體中的生存有極其重要的作用，同時也是在漫長的進化過程中壓力選擇的結果。通過對其多樣性產生的遺傳基礎和進化的研究可以揭示致病菌的進化和形成機理。 在世界上首次對有特殊進化地位的鮑氏志賀氏菌13型O-抗原的遺傳、結構和進化進行全面的研究。研究結果表明它的O-抗原的主鏈上有罕見的糖磷酸鍵，具有酸不穩(wěn)定性。第一個基因的上游的殘余的IS的存在和3′端部分序列的較高的相似性暗示至少它的部分序列起源于霍亂弧菌O37，也與大腸桿菌O163的親緣關系近。 通過對大腸桿菌O52 O-抗原的遺傳和結構的研究發(fā)現，它是一個依賴于ABC-2轉運子合成的由異源雙糖組成的O-抗原，而且合成它的基因簇定位于galF和gnd基因之間。這在世界上屬于首次發(fā)現。我們又通過缺失和互補方法及SDS-PAGE和銀染技術鑒定了wzm基因和糖基轉移酶基因orf16，并證實了wzm基因的存在和orf16已經失去了功能。又進一步預測了單糖D-Fucf的生物合成途徑。 當破譯了鮑氏志賀氏菌10型的O-抗原基因簇后，發(fā)現它與鮑氏志賀氏菌6型的整個O-抗原基因簇序列有99.8-100％的相同性。進一步對它的O-抗原的結構、遺傳和進化及致病菌形成機理進行研究，首次發(fā)現一個完整的基因簇的橫向轉移是由一個IS插入到重要的功能基因內引起，也發(fā)現了一株進化歷史最短的志賀氏菌：鮑氏志賀氏菌6型，是在距今不到1萬年才從鮑氏志賀氏菌10型進化而來。 普遍認為志賀氏菌起源于大腸桿菌，但是對痢疾志賀氏菌3型和大腸桿菌O164的進化關系和致病菌形成機理的研究揭示出一個特例，就是大腸桿菌O164是在近期從痢疾志賀氏菌3型進化而來。而且通過序列的精確比對發(fā)現由于2個堿基的插入造成移碼突變，導致重要功能基因缺失，產生了新的O-抗原，形成了新的致病菌：大腸桿菌O164--一株能引起爆發(fā)流行的EIEC。 也研究了O-抗原結構很相似的大腸桿菌O56和O24的進化關系，基因的同源性較高，表明它們的進化關系密切。缺失了這兩個菌的wzx、wzy基因和O24中預測不出功能的orf9基因，并在同一菌中進行了相應基因的互補實驗。表明它們都是有功能的。 志賀氏菌是隨著人類進化而形成的非常重要的致病菌，和大腸桿菌有非常近的親 南開大學博士畢業(yè)(學位)論文 之 碑 緣關系，本文通過對具有相同O一抗原結構的4對志賀氏菌與大腸桿菌序列分析發(fā)現， 它們的序列相似性很高，具有相同的基因相同的排列順序。進一步證實志賀氏菌屬應 被劃入致病性的大腸桿菌屬更合適。此外，發(fā)現二IB基因也是細菌橫向轉移的一個同 源重組位點。對鮑氏志賀氏菌2型和大腸桿菌054序列的破譯和分析發(fā)現2切了C基因很 特殊，它遠離另三個基因二IBI萬1位于基因簇的3‘端。同樣的情況出現在鮑氏志賀氏菌 9型中，這意味著柳了C在這三個菌中是一個重組位點。這兩個結果使我們對同源重組 位點有更新的認識。那就是一翻了雙必盆C是細菌O一抗原基因簇同源重組頻繁的區(qū)域，但 在不同的菌中，重組位點會發(fā)生改變。 本研究中有10個菌有二nB和二刀c，加上本實驗室己經破譯及網上搜索到的大腸 桿菌的二nB和二刀C基因序列做進化樹。這是第一次在大腸桿菌中對朋nB和二nC基因 進行系統分析。使我們對*nB和~C的起源和介導的DNA的橫向轉移有更深刻的認識。 大腸桿菌01360一抗原中含有非常罕見的人體內很需要的單糖Pseudaminic acid 的同類糖。大腸桿菌0136是一株EIEC，與另兩株EIEC大腸桿菌0164和0124有血清 交叉反應，我們破譯它的序列后，通過同源性搜索鑒定了它的合成酶基因，并通過缺 失和互補對仲冬廠進行鑒定。 本研究破譯的多個基因簇中都含有插入序列，發(fā)現這些插入序列可以分成兩類: 一類是插入到O一抗原基因簇的重要功能基因中，導致基因缺失，產生新的O一抗原，形 成新的致病菌。如:鮑氏志賀氏菌6型，大腸桿菌0164的IS，而且它們都是在很近的 時期形成的，這種插入序列很少見。另一類是插入到O一抗原基因簇的ga1F和第一個 基因之間，如鮑氏志賀氏菌13型和大腸桿菌056中的1S，大腸桿菌088和0161中的 H一reapeat。暗示這類插入序列能通過同源重組介導DNA的橫向轉移。所以，我們的結 果也表明插入序列在細菌O一抗原的進化和致病菌的形成中扮演重要角色。 總之，本研究破譯了9株志賀氏菌和巧株大腸桿菌的O一抗原基因簇的全序列，通 過對它們的遺傳和進化的研究和通過合作對重要或特殊的O一抗原結構的研究及通過缺 失和互補方法并結合SDS一PAGE和銀染技術對重要基因的鑒定，共同診釋了志賀氏菌和 大腸桿菌0一抗原基因簇的遺傳特征，揭示了致病菌的進化和形成機理，也使我們對志 賀氏菌和大腸桿菌的關系有了更清楚的認識。也表明DNA的橫向轉移是細菌表面多糖抗 原基因簇進化的重要途徑。這是世界上首次如此系統的
【學位授予單位】：南開大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R378
【圖文】：

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}遭啄畫蔽奮刁圖IK5的K一抗原的合成模型圖2K5的K一抗原的基因簇3.合成大腸桿菌K一抗原的基因簇合成大腸桿菌K一抗原的基因在染色體上也是成簇排列，在組1和4中稱為cPs(eapsuzegenecluster)，位于。一抗原基因簇上游的JuMstart序列之前〔65〕，也就是挨著O一抗原基因簇。在組2和3中稱為kPs，圖2列出K5的K一抗原基因簇。圖3為組1和大腸桿菌K12的K一抗原基因簇:廳舊‘rstralnscaayaf]lse婦mont口胡了打劃刀昭日怕50刁2腳心切。幣旋哪幻嘆陽用口按翔”婦nk時妙Is自協汀舊門污·食勸歸沁卯。eS喇魷‘口p了岡比污翩ke戶舊偽腳鄺Iorg的中，翻p，“招‘。洲m.八日C時叫時l破IF尹E.COIISt沮insWithgroupIK朗tigens動叻時，~，孤，伽，~印s(GROUP1CPSBIOSYNTHESIS)而舊印口9峨NTIGENHISTIDINEeIOSYNTHESIS)BIOSYNTHESIS

了大腸桿菌056的甲z了和~，突變菌株都不在產生正常的LPS。缺失了。基因的突變菌株H1097只產生核心寡糖和類脂A，缺失了班足y基因的突變菌株H1096只產生類脂A加核心寡糖加一個O一單位(見圖4A)。用含有大腸桿菌056的分邁獷基因的表達質粒pLWIOOS和~基因的表達質粒pLWIOOg分別轉化大腸桿菌056的缺失突變菌株后得到互補菌Hll02和HllO3，電泳表明互補菌產生正常的LPS(見圖4B)。這些結果表明大腸桿菌056的邵邏獷和~基因是有功能的，鑒定了口2，f濘是甲藝了，口廠廠夕是二x基因。

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本文編號：2794622