【摘要】：[研究背景] 大面積骨缺損的治療一直是一個困擾臨床醫(yī)生的技術難題。除骨移植外,生長因子,生物材料及相關干細胞研究的組織工程學為治療大面積骨缺損提供了新的治療思路。生長因子progranulin (PGRN)是一種多功能蛋白,已經有研究證明PGRN在發(fā)育過程中可以促進軟骨細胞分化及軟骨內成骨。我們知道在骨修復過程中軟骨形成軟骨痂后成骨,對修復缺損起到非常關鍵的作用。且近期發(fā)現,PGRN通過與腫瘤壞死因子TNF-α的受體TNFR1/2相結合,保護了免疫性關節(jié)炎中骨組織不受侵蝕。生長因子PGRN促軟骨細胞分化,抑破骨的作用引起我們濃厚興趣,是否可將PGRN引入治療大而積骨缺損呢?直至目前,PGRN在骨修復過程中所起作用及其可能涉及的相關機制尚無報道。 [實驗方法] 在本實驗中,我們使用多種轉基因小鼠,包括野生型小鼠,PGRN基因缺失小鼠, TNFR1基因缺失小鼠,TNFR2基因缺失小鼠,’TNF-α轉基因小鼠并應用多種手術誘導模型包括橈骨節(jié)段性骨缺損模型,股骨鉆孔骨缺損模型,肌肉內異位骨生成模型和股骨節(jié)段性骨缺損模型研究PGRN在骨修復過程中的作用和相關機制。 [實驗結果] 通過本實驗,我們發(fā)現手術誘導的骨缺損模型中,PGRN基因缺失型小鼠出現骨修復過程遲緩,主要表現為節(jié)段性骨缺損模型建立后,在各個檢測時間點的骨斷端問距較野生型對照組明顯增大,提示新骨形成緩慢,而局部使用PGRN重組蛋白可加速野生型小鼠節(jié)段性骨缺損的骨修復過程。除此之外,我們發(fā)現PGRN在BMP-2(骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2)誘導的骨生成過程中起到不可或缺的作用,因為PGRN基因缺失型小鼠中BMP-2誘導的異位骨生成較野生型小鼠顯著減少,且軟骨內成骨過程明顯減緩,而在PGRN基因缺失型小鼠中使用PGRN重組蛋白治療后可以改善基因缺失導致的BMP-2異位成骨誘導不良現象。另外,我們發(fā)現PGRN介導的促骨修復作用與TNFR2密切相關。CT等影像學結果顯示,在TNFR2基因缺失型小鼠中,上述PGRN促骨修復作用幾乎完全消失。同時我們發(fā)現,BMP-2介導的異位骨形成在TNF-α轉基因小鼠中被明顯抑制。組織學分析發(fā)現在TNF-α轉基因小鼠中,新生骨的邊緣部分破骨細胞異�；钴S,提示TNF-α的過量表達導致了新生骨侵蝕加劇,最終使新生骨量減生。我們將PGRN重組蛋白與BMP-2同時作用于TNF-α轉基因小鼠,結果發(fā)現這種成骨減少現象明顯改善,組織學分析發(fā)現PGRN的治療使TNF-α轉基因小鼠中破骨細胞活性降低,這提示了PGRN在骨修復過程中也可能是通過抑制炎性反應及過度活躍的破骨細胞活性起作用的 [結論] 本實驗通過使用多種轉基因小鼠及數種手術誘導模型,驗證了PGRN在骨修復過程中起到促軟骨細胞分化,抑破骨的作用。機制方面的研究顯示,這種作用是通過與BMP-2及TNF-α/TNFR通路相互作用來實現的,這也提示我們PGRN有可能成為治療骨缺損的新分子,尤其在患者處于炎性狀態(tài)時發(fā)揮其獨特作用。 [研究背景] 皮膚炎性疾病,包括銀屑病等,屬于免疫炎性疾病的一類,困擾著大量患者。但到目前為止,其發(fā)病機制及治療措施仍然有待進一步研究。在多種皮膚炎癥的發(fā)病過程中,最重要的細胞因子之一是腫瘤壞死因子(TNF-α),起到非常關鍵的作用。TNF-a可以通過激活相關炎性通路如NF-κB信號通路從而促進下游因子表達,繼而導致炎癥發(fā)生。因此,對TNF-α的拮抗就成為非常有前景的治療方法之一。到目前為止,已經有數種針對TNF-α的藥物應用于臨床,并在類風濕關節(jié)炎,銀屑病以及潰瘍性結腸病等疾病中發(fā)揮治療作用。然而,目前所開發(fā)的抗TNF-α藥物應用于自身免疫性疾病患者后,仍有約半數患者對這些治療藥物反應不敏感或無效。因此,進一步開發(fā)新的TNF-α相關抑制劑對于治療這些患者來說是十分必要的。Progranulin (PGRN)是一種多功能蛋白,在諸多生理及病理過程中發(fā)揮重要作用。PGRN以及其衍生工程蛋白Atsttrin已被報道可以通過與TNF-α的細胞表面受體TNFR1/2相互結合拮抗TNF-a所導致的NF-κB信號通路激活和炎性作用,并在小鼠模型中對抗免疫性關節(jié)炎(Tang, W.,等,Science,2011)。PGRN及Atsttrin的拮抗機制與前期藥品不同,因為前期應用于臨床的TNF-α抑制劑主要包括TNF-α的抗體或TNF-α受體類似物,通過捕獲TNF-α,封閉其結合位點,從而防止其與細胞表面受體TNFR1/2相結合來實現對TNF-α功能的抑制,而PGRN及Atsttrin則通過與TNF-α受體競爭性結合起到抗炎作用。直至目前,PGRN在皮膚炎癥中的作用尚無人報道。因此,在本課題中,我們使用相關實驗,研究PGRN及Atsttrin在皮膚炎癥中的作用及相關機制。 [實驗方法] 1. PGRN在人和小鼠正常皮膚組織中的表達由免疫組化,實時熒光定量PCR及Western蛋白印跡實驗檢測。 2.在野生型小鼠和PGRN基因缺失型小鼠中誘導oxazolone皮膚炎癥模型,通過組織學,qPCR, WB以及流式細胞技術等方法,對比野生型小鼠和PGRN從因缺失型小鼠中皮膚炎癥的發(fā)生發(fā)展情況及使用Atsttrin治療后皮膚炎癥的差別。 3.在各個實驗小組中對NF-κB信號通路的指標進行檢測。 [實驗結果] 1.兔疫組化示,PGRN在人和小鼠皮膚中均有表達。qPCR及WB發(fā)現PGRN在皮膚炎性疾病中表達上升。 2. Oxazolone誘導的皮炎模型中,較之野生型小鼠,PGRN基因缺失小鼠的皮炎程度加重,表現在誘導后鼠耳外觀腫脹,厚度增加,同時qPCR示炎性反應的相關標志性分子包括包括白細胞介素1(IL-1β),白細胞介素6(IL-6),環(huán)氧化酶2(COX-2)以及誘導性一氧化氮合成酶(iNOS)表達增多。另外,流式細胞學檢測結果示在PGRN基因缺失小鼠頸部引流淋巴結中,其調節(jié)性T細胞的比例較野生型明顯降低,使用PGRN衍生的工程蛋白Atsttrin治療后,在野生型小鼠中,Oxazolone誘導的皮炎得以明顯控制,包括誘導后耳厚度增加程度,即耳腫脹程度得以控制；組織學發(fā)現表皮組織因皮炎所致的增生程度降低,而炎性相關的標志性分子如白細胞介素1(IL-1β),白細胞介素6(IL-6),環(huán)氧化酶2(COX-2)以及誘導性一氧化氮合成酶(iNOS)水平也相較于PBS對照治療組顯著性下降。 3.我們發(fā)現PGRN及Atsttrin在皮膚炎癥中的保護性作用可能通過調節(jié)NF-κB信號通路的活性來實現的。在Oxazolone誘導的皮炎模型中,PGRN基因缺失小鼠局部皮膚中NF-κB信號通路組成部分NF-κB2的表達上升,而NF-κB通路抑制分子IκB的磷酸化加強,反映NF-κB通路活性增強。同時,在野生型皮炎模型中使用Atsttrin治療后,皮炎中增強的NF-κB信號通路活性得以有效控制。 [結論] 我們研究發(fā)現皮膚炎癥中PGRN表達上調。構建動物模型證明PGRN缺失致使皮炎程度加劇,Atsttrin治療后可減輕皮炎程度。并進一步探究了參與此過程的NF-κB信號通路的活性變化。這一研究不但首次觀察了內源性PGRN在皮膚炎癥中的作用,也提示其衍生工程蛋白Atsttrin可能作為一種治療炎性皮膚疾病的新型藥物,應用于未來臨床之中。 [研究背景] 椎間盤退行性變是發(fā)病率最高的退行性疾病之一,由多種因素引起。其特征為椎間盤在形態(tài)學和生物力學方面發(fā)生顯著性變化,體現在新骨形成,軟骨破壞和破骨活躍,并最終導致椎間盤結構紊亂,活動受限,且可出現下腰痛癥狀。在這一退變過程中所涉及的相關分子機制尚不明確,目前尚無有效控制或逆轉的治療措施。Progranulin (PGRN)作為一種多功能生長因子,與神經及關節(jié)軟骨退變性疾病有密切關系。近期,有研究發(fā)現PGRN可以競爭性結合腫瘤壞死因子TNF-α的受體TNFR1/2,抑制免疫性關節(jié)炎模型中NF-κB信號通路的激活,從而保護關節(jié)軟骨不受破壞。另有報道稱在神經系統(tǒng)中,PGRN的缺失可導致wnt/β-catenin信號通路激活。而NF-κB和wnt/β-catenin通路與椎間盤退變關系密切。然而,PGRN在椎間盤退變過程中的作用尚無相關報道；是否通過上述兩條通路發(fā)揮作用有待進一步求證。此實驗主要研究正常以及退變狀態(tài)下PGRN在椎間盤組織的表達情況,探索PGRN在椎間盤老化退變過程中的作用,并闡述相關分子機制。 [實驗方法] 1.本實驗采用免疫組化(IHC),實時熒光定量PCR (qPCR)以及Western免疫蛋白印跡實驗技術(WB)檢測人與小鼠椎間盤中PGRN的表達情況。 2.對4月齡,6月齡及9月齡的野生型和PGRN基因缺失型小鼠椎間盤進行HE染色分析一般形態(tài)學變化；Safranin O染色分析軟骨成分變化；IHC檢測椎間盤基質aggrecan的降解產物；破骨細胞活性由TRAP染色檢測。另外進行影像學CT檢測。qPCR檢測椎間盤退變標志性基因的mRNA水平,包括堿性磷酸酶(ALP)骨鈣素(osteocalcin),金屬蛋白酶13(MMP13),10型膠原,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)及織蛋白酶K (Cathepsin K) 3.野生型和PGRN基因缺失型小鼠椎間盤組織中NF-κB和wnt/β-catenin信號通路的表達與活性也通過qPCR, WB及兔疫組化實驗方法進行檢測。 [實驗結果] 1.免疫組化實驗結果顯示PGRN在人和小鼠的椎間盤中均有表達,qPCR以及WB結果證實PGRN水平隨老化過程而升高。 2.通過比較不同年齡組野生型和PGRN基因缺失型小鼠椎間盤白發(fā)性退變過程,發(fā)現PGRN基因缺失型小鼠椎間盤組織終板出現骨贅形成,而相鄰椎體內松質骨出現骨質疏松情況。Safranin O染色及aggrecan降解產物的免疫組化結果顯示PGRN基因缺失時椎間盤組織中軟骨結構破壞顯明加重,退變臨床評分明顯高于野生型對照組。另外,與同年齡野生型小鼠相比,qPCR示PGRN基因缺失型小鼠椎間盤組織中的軟骨退變相關于指標水平顯著性上升。 3.在實驗中發(fā)現PGRN基因缺失導致椎間盤組織中NF-κB和wnt/β-catenin信號通路相關組分表達升高,活性增強,分析退變加速可能是由過度激活此二種信號通路所致。 [結論] PGRN在維持椎間盤組織穩(wěn)態(tài)中起到非常重要的作用,PGRN基因缺失導致椎間盤退變加速。這為防治椎間盤退變性疾病提供了新的潛在作用靶點。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【共引文獻】
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本文編號：
2790688
