【摘要】：隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活方式的改變，人類疾病譜正在發(fā)生變化，慢性腎臟�。–KD)已呈現(xiàn)流行特征。CKD具有患病率高、醫(yī)療費(fèi)用巨大、易合并心血管疾病而導(dǎo)致病死率和致殘率高等特點(diǎn)，目前已成為影響我國國民健康的主要疾病[1]。腎小管間質(zhì)纖維化是各種原因引起的CKD發(fā)展到終末期腎衰竭的共同歸路。近年來研宄表明，腎小管間質(zhì)損傷的嚴(yán)重程度是影響CKD預(yù)后的決定因素[2]。因此，如何早期預(yù)防和減輕腎小管間質(zhì)的損傷，是延緩CKD的慢性進(jìn)展、減輕或消除腎臟纖維化的關(guān)鍵所在，也是腎臟疾病防治戰(zhàn)略中最重要的步驟之一。業(yè)已證實(shí)，上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞之間可相互轉(zhuǎn)變M。在腎臟胚胎發(fā)育期，間充質(zhì)細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀ぜ?xì)胞，即MET (mesenchymal-epithelialtransition),形成由上皮細(xì)胞組成的管樣結(jié)構(gòu)，最終逐漸分化并形成腎小管和腎小球；而在成年期，腎小管上皮細(xì)胞受到損傷因素刺激后可發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，由上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為間充質(zhì)細(xì)胞，造成腎小管間質(zhì)損傷，最終發(fā)展為腎小管間質(zhì)纖維化。對腎小管間質(zhì)纖維化的研宄發(fā)現(xiàn)，超過1/3的間質(zhì)成纖維細(xì)胞來源于局部腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生的EMT[4]，因此，EMT是導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化的中心環(huán)節(jié)之一[5’6]。 本研宄小組前期應(yīng)用抑制性差減雜交技術(shù)構(gòu)建新生大鼠和生后21天大鼠腎臟發(fā)育差減文庫，發(fā)現(xiàn)多個拷貝的PEA3基因。PEA3屬于Ets癌基因家族成員，其編碼蛋白C端含有一個非常保守的Ets結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域同時也是DNA結(jié)合域。Ets家族蛋白具有調(diào)控多種基因表達(dá)的作用，包括調(diào)控生長、轉(zhuǎn)錄、T細(xì)胞活化和器官發(fā)育等。PEA3主要表達(dá)于那些需經(jīng)歷上皮一基質(zhì)相互誘導(dǎo)發(fā)育的組織器官，參與其發(fā)育過程[7]。課題組前期研宄發(fā)現(xiàn)，PEA3在胚胎腎發(fā)育中顯著高表達(dá)，其通過誘導(dǎo)WH表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞向正常腎組織結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)MET，形成由上皮細(xì)胞組成的管樣結(jié)構(gòu)，最終逐漸分化并形成腎小管和腎小球，該作用與BMP-7在胚胎發(fā)育中的作用相似。業(yè)已證實(shí)，BMP-7可通過阻斷腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而減輕和延緩腎臟纖維化，且通過TESS啟動子分析軟件發(fā)現(xiàn)BMP-7啟動子區(qū)有兩個PEA3結(jié)合位點(diǎn)，因此，我們推測PEA3可能通過上調(diào)BMP-7阻斷EMT。 除此之外，已有文獻(xiàn)報道，TGF-f31可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞ROS釋放增多，ROS繼而增強(qiáng)smad2磷酸化最終加劇EMT的發(fā)生[8]。本研宄小組亦發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙可以加劇醛固酮誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞EMT，并驗(yàn)證了PGC-1a過表達(dá)可以阻斷線粒體功能障礙進(jìn)而抑制EMT。這些為探討EMT的發(fā)生機(jī)制及干預(yù)靶點(diǎn)提供了新的視野。PGC-1a在阻斷線粒體功能障礙中發(fā)揮極其重要的作用，其最主要的生物學(xué)功能是刺激線粒體的生物合成以及增強(qiáng)線粒體的代謝能力，通過刺激線粒體轉(zhuǎn)錄因子A (TFAM)的表達(dá)調(diào)節(jié)mtDNA的合成；通過對線粒體核呼吸因子的調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)線粒體氧化磷酸化過程，促進(jìn)ATP的合成；通過激活經(jīng)典抗氧化酶、UCPs等多條抗氧化防御系統(tǒng)來阻止ROS引起的損傷。于是，我們設(shè)想PEA3是否可以通過上調(diào)PGC-1a發(fā)揮阻斷EMT的作用。 PEA3在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和腎小管間質(zhì)纖維化中的作用尚不清楚，因此本研宄擬通過對實(shí)驗(yàn)性腎臟病動物模型的觀察及體外腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)，探討PEA3在腎小管間質(zhì)纖維化中的作用及其機(jī)制，并對其進(jìn)行相關(guān)干預(yù)實(shí)驗(yàn)。 全反式維甲酸（ATRA)是維生素A的活性代謝產(chǎn)物，在胚胎及成年組織中有多種生物學(xué)活性，如在細(xì)胞增生、凋亡、分化、生殖、維持細(xì)胞正常功能、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。近年來全反式維甲酸在腎臟疾病中的作用受到國外學(xué)者的關(guān)注。多項(xiàng)研宄結(jié)果證實(shí)，ATRA具有改善腎小球肥大，延緩腎臟纖維化，保護(hù)腎功能的作用。但ATRA對于腎臟纖維化的影響尚缺乏深入研宄。已有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸能夠在轉(zhuǎn)錄水平上上調(diào)BMP-7的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)源性BMP-7增多，進(jìn)一步通過與受體結(jié)合等多種途徑發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用，有效地延緩了糖尿病腎臟纖維化進(jìn)程。因此，本研宄試圖觀察ATRA對腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用并探討其具體作用機(jī)制。 第一部分：PEA3在實(shí)驗(yàn)性腎臟病動物模型腎組織中的表達(dá) 目的觀察PEA3在實(shí)驗(yàn)性腎臟病動物模型腎組織中的表達(dá) 方法建立如下實(shí)驗(yàn)性腎臟病動物模型：順鉑模型、慶大霉素模型、醛固酉同模型、阿霉素腎病模型及UUO動物模型，采用Real-time PCR、western blot及免疫組化的方法，檢測PEA3在實(shí)驗(yàn)性腎臟病動物模型腎組織中的表達(dá)變化。 結(jié)果Real-time PCR、western blot結(jié)果顯不：UUO模型組較正常小鼠組PEA3表達(dá)明顯增加；免疫組化結(jié)果顯示：UU0模型組第七天PEA3表達(dá)明顯增加，第14天達(dá)到高峰，主要表達(dá)于腎小球和腎間質(zhì)細(xì)胞，少量表達(dá)于腎小管；慶大霉素組PEA3較正常組表達(dá)明顯升高，于第5天達(dá)到高峰，之后逐漸下降，主要表達(dá)于損傷的腎小管；阿霉素組較正常組PEA3表達(dá)顯著增加，主要表達(dá)于腎小管；醛固酮模型組從第三天開始腎小球中可見少量PEA3表達(dá)，之后逐漸增加，多表達(dá)于腎小管和腎小球；順鉑模型(20mg/kg)組較正常組PEA3表達(dá)升高，主要見于腎小管。 結(jié)論隨著實(shí)驗(yàn)性腎臟病動物模型腎臟纖維化程度加重，PEA3表達(dá)逐漸增加，提示該基因可能在腎臟纖維化過程中發(fā)揮一定作用；且其表達(dá)多見于腎小管及腎小球，提示其可能參與腎小管上皮細(xì)胞一間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程。 第二部分：PEA3在腎小管上皮細(xì)胞一間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用及機(jī)制研究 目的本研宄旨在從實(shí)驗(yàn)性腎臟病動物模型中觀察到的現(xiàn)象探討PEA3在腎小管上皮細(xì)胞一間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程中的作用及其可能的機(jī)制。 方法（1)構(gòu)建PEA3真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2)，應(yīng)用Real-time PCR和Western Blot技術(shù)觀察該細(xì)胞中PEA3和BMP_7mRNA和蛋白表達(dá)；（2)過表達(dá)PEA3的HK-2細(xì)胞，應(yīng)用TGFβ-1(5ng/ml)刺激或應(yīng)用BMP-7siRNA預(yù)處理后再加入TGFβ-1刺激，Real-time PCR和Western Blot檢測Smad-1，2，3，5，8和a-SMA、 CTGF、 Collagen I (Coll)、 E-cadherin、ZO-1表達(dá)；（3)采用RNAi技術(shù)，構(gòu)建PEA3siRNA，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HK_2細(xì)胞以抑制PEA3表達(dá)，再加入TGFβ-1刺激，應(yīng)用Real-time PCR和Western Blot檢測PEA3及BMP-7mRNA和蛋白表達(dá)、Smad-1,2，3，5，8和a-SMA、CTGF、Coll、E-cadherin、ZO-1表達(dá)；(4)體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，應(yīng)用TGF-^1刺激檢測不同時間點(diǎn)線粒體功能障礙的損傷程度；（5)共轉(zhuǎn)染PEA3和PGC-1α siRNA至HK-2細(xì)胞，加入TGFβ-1刺激，應(yīng)用熒光探針2，7-二氯二氫熒光素乙酰乙酸（DCFDA)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(R0S)的變化；JC-1檢測線粒體膜電位；Real-timePCR檢測線粒體DNA拷貝數(shù)；Real-timePCR和Western Blot檢測PEA3、PGC1_a、TFAM、E-cadherin、Vimentin、ILK禾口a-SMA的表達(dá)情況。 結(jié)果（1) Real-time PCR和Western Blot結(jié)果顯示：PEA3過表達(dá)組PEA3mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，且PEA3過表達(dá)可上調(diào)BMP-7mRNA和蛋白表達(dá)；（2)HK-2細(xì)胞加入TGFβ-1刺激后，a-SMA, CTGF和Coll表達(dá)及smad2/3磷酸化顯著增加，而E-cadherin和Z0-1表達(dá)以及smadl/5/8磷酸化降低；PEA3過表達(dá)后顯著抑制TGFβ-1誘導(dǎo)的a-SMA, CTGF和Coll表達(dá)及smad2/3磷酸化，并上調(diào)E-cadherin和Z0-1表達(dá)及smadl/5/8磷酸化；共轉(zhuǎn)染PEA3和BMP_7siRNA的HK-2細(xì)胞加入TGFβ-1刺激，BMP-7siRNA顯著降低了PEA3對TGFβ-1的保護(hù)作用；(3)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染PEA3siRNA后，PEA3表達(dá)顯著下降，其抑制率達(dá)50%。PEA3siRNA轉(zhuǎn)染組BMP-7mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，該組再加入TGFβ-1刺激，較未加入PEA3siRNA預(yù)處理組，a-SMA、CTGF、Coll、smad2/3磷酸化增加，E-cadherin, ZO-1、smadl/5/8磷酸化減少;(4) TGFβ-1可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生線粒體功能障礙；（5) PEA3過表達(dá)可上調(diào)PGC-1α和TFAM表達(dá)，并緩解TGF-β-1誘導(dǎo)的線粒體功能障礙；轉(zhuǎn)染PGC-1α siRNA后減弱了PEA3對TGFβ-1誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和EMT的保護(hù)作用。 結(jié)論P(yáng)EA3可通過上調(diào)BMP-7表達(dá)而部分阻斷TGFβ-1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化；PEA3可通過上調(diào)PGC-1α緩解TGFβ-1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞線粒體功能障礙進(jìn)而部分阻斷TGF-1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化。 第三部分：PEA3在全反式維甲酸阻斷腎小管上皮細(xì)胞一間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用 目的探討全反式維甲酸對腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響及機(jī)制研宄，并觀察PEA3在該過程中發(fā)揮的作用。 方法（1)體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，應(yīng)用ATRA預(yù)處理30分鐘后再加入TGF-旦1刺激48h，應(yīng)用Real-time PCR禾口Western Blot檢測EMT相關(guān)分子E_cad-herin、ZO-1、a-SMA、Coll和CTGFmRNA和蛋白表達(dá);(2)予UUO小鼠ATRA處理，Real-time PCR和Western Blot檢測TGF-、E-cadherin、ZO-1、a-SMA、Coll和CTGF mRNA和蛋白表達(dá)；(3)體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，構(gòu)建BMP-7啟動子和蟲熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入HK-2細(xì)胞，加入ATRA刺激后，應(yīng)用蟲熒光素酶活性檢測法檢測BMP-7啟動子的活性，Real-time PCR和Western Blot檢測BMP-7表達(dá)，Western Blot檢測Smadl/5/8磷酸化；(4) HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染BMP-7siRNA后再加入ATRA和TGFβ-1處理，應(yīng)用Real-time PCR和Western Blot檢測E-cadherin、ZO-1、a-SMA、Coll和CTGF mRNA和蛋白表達(dá);(5)將BMP-7啟動子和蟲熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，分別過表達(dá)和干擾RARa和RXRa基因，加入ATRA刺激細(xì)胞24h，檢測熒光素酶活性；（6)應(yīng)用Western Blot檢測不同劑量ATRA刺激細(xì)胞后PEA3的表達(dá)變化，如上調(diào)，再應(yīng)用Chip檢測ATRA與PEA3的結(jié)合情況；將BMP-7啟動子和蟲熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，分別過表達(dá)和干擾PEA3，加入ATRA刺激細(xì)胞24h，檢測熒光素酶活性；（7)應(yīng)用Chip檢測RARa與PEA3結(jié)合情況，分別轉(zhuǎn)染RARa質(zhì)粒、RXRa質(zhì)粒、PEA3siRNA后，加入ATRA刺激，檢測BMP-7熒光素酶活性。 結(jié)果（l)ATRA明顯呈劑量依賴性地抑制TGFβ-1誘導(dǎo)的EMT，即抑制TGF-β-1誘導(dǎo)的a-SMA、Coll和CTGF表達(dá)而上調(diào)E-cadherin和Z0-1表達(dá)；（2)Real-time PCR和Western Blot研宄結(jié)果表明，UU0小鼠腎組織中TGF-e、a-SMA,ColI和CTGF表達(dá)顯著上調(diào)，而E-cadherin和Z0_1表達(dá)則顯著下降，ATRA處理后明顯抑制UU0的纖維化；（3) ATRA呈劑量依賴性上調(diào)BMP-7啟動子活性，促進(jìn)BMP-7mRNA和蛋白表達(dá)，同時我們還發(fā)現(xiàn)，ATRA顯著促進(jìn)了Smadl/5/8磷酸化，提示ATRA可活化BMP-7/smadl，5，8信號通路。（4) BMP_7siRNA阻斷ATRA對EMT的抑制作用，BMP-7siRNA促進(jìn)了a-SMA, Coll和CTGF表達(dá)而抑制E-cadherin和Z0-1表達(dá)。(5)過表達(dá)RAR a和RXR a后加入ATRA刺激，BMP-7熒光素酶活性增加，且RARa和RXRa共過表達(dá)組，增加最明顯，反之，RARa和RXRa干擾后加入ATRA刺激，BMP-7熒光素酶活性降低，且RAR a和RXRa共干擾組，降低最明顯；（6)過表達(dá)PEA3后加入ATRA刺激，BMP-7熒光素酶活性增加，反之，干擾PEA3后加入ATRA刺激，BMP-7熒光素酶活性降低；（7)ATRA受體RAR a可與PEA3直接結(jié)合，且RAR a、RXR a與PEA3可共同作用于ATRA誘導(dǎo)BMP-7表達(dá)的過程。 結(jié)論體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)均提示ATRA可以阻斷腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化，且可能通過PEA3/BMP-7/smadl，5，8信號途徑發(fā)揮保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 錢明;甘衛(wèi)華;陳榮華;潘曉勤;費(fèi)莉;;外源性結(jié)締組織生長因子對腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化和膠原合成效應(yīng)[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2006年02期

2 薛痕;骨形成蛋白-7與腎纖維化[J];國外醫(yī)學(xué).泌尿系統(tǒng)分冊;2004年02期

3 王延葉,李榮山;TGF-β1/Smad與腎臟間質(zhì)纖維化[J];國外醫(yī)學(xué).泌尿系統(tǒng)分冊;2005年06期

4 姚春萌;郭漢城;劉俊蘭;關(guān)天俊;凌毅生;;全反式維甲酸對糖尿病大鼠腎臟組織BMP-7表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)代謝的影響[J];中國臨床藥學(xué)雜志;2012年01期

5 張農(nóng),劉琛,林文生,郭慕依;全反式維甲酸可增強(qiáng)大鼠系膜細(xì)胞uPA和MMP-2表達(dá)[J];復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版);2001年04期

6 楊勤;韓冰;謝汝佳;程明亮;;骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7及抑制性Smads在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)變化[J];生理學(xué)報;2007年02期

7 李曼,忻菁,顧勇,彭艾,劉少軍,朱秋毓,林善錟;全反式維甲酸對大鼠殘余腎功能的保護(hù)作用及其機(jī)制[J];中國病理生理雜志;2005年07期

8 陳香美;王海燕;;提高慢性腎臟病的知曉率、治療率和控制率減輕對國民健康的危害[J];中華內(nèi)科雜志;2006年06期

本文編號：2790799