【摘要】：炎癥反應(yīng)是機(jī)體對(duì)抗外來致病因素侵襲的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)。但若過分強(qiáng)烈，則體內(nèi)的炎癥細(xì)胞被過度激活，持續(xù)大量地表達(dá)、產(chǎn)生和釋放多種促炎因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等，這些促炎因子又以“自分泌”或“旁分泌”的方式誘生多種炎癥介質(zhì)的分泌，由此激發(fā)炎癥連鎖反應(yīng)，以致失去控制，形成全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），并進(jìn)而發(fā)展為多器官功能障礙綜合征（MODS）。 感染性因素和非感染性因素均可刺激宿主炎癥細(xì)胞，產(chǎn)生大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)。其中，G-菌菌壁的主要活性成分脂多糖（LPS）是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和釋放炎癥介質(zhì)最強(qiáng)烈、最有效的激活物，在G-菌感染和內(nèi)毒素休克發(fā)病中發(fā)揮重要作用。 在SIRS和MODS的發(fā)病過程中，肺臟是公認(rèn)的最易受損的靶器官。同時(shí)也是MODS重要的動(dòng)力器官，因?yàn)榉问茄装Y細(xì)胞激活和聚積的重要場(chǎng)所，它可誘發(fā)或加重局部和全身炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)組織損傷，促進(jìn)SIRS的發(fā)生和發(fā)展。巨噬細(xì)胞是體內(nèi)產(chǎn)生和釋放多種炎癥介質(zhì)、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。肺巨噬細(xì)胞包括肺泡巨噬細(xì)胞（AMs）、肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞（PIMs）、肺血管內(nèi)巨噬細(xì)胞、胸膜巨噬細(xì)胞、血管壁巨噬細(xì)胞、支氣管壁巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，其中，PIMs在炎癥反應(yīng)中的作用日益受到人們的關(guān)注。與AMs一樣，PIMs也具有吞噬能力和釋放各種炎癥介質(zhì)的功能，尤其具有較強(qiáng)的分泌IL-1、IL-6的能力；在內(nèi)毒素血癥時(shí)，PIMs較AMs受到LPS攻擊更早，且其吞噬功能、對(duì)補(bǔ)體的趨化作用以及產(chǎn)生氧自由基的能力明顯強(qiáng)于AMs，在肺組織的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。 膽囊收縮素（cholecystokinin, CCK）是一種典型的腦腸肽，它不但具有胃腸激素的功能，還以神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的形式發(fā)揮著重要的作用。近年的研究表明，八肽膽囊收縮素（CCK-8）具有一定的抗炎作用，它可減輕LPS引起的大鼠心肌組織、肺臟、脾臟和腎臟白細(xì)胞浸潤、毛細(xì)血管血液淤積等征象，抑制體內(nèi)TNF-α、IL-1、IL-6等促炎因子的升高；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CCK-8可抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠PIMs的NF-κB活性和 WP=6 mCD14的表達(dá)，導(dǎo)致PIMs對(duì)LPS的敏感性降低，從而抑制炎癥反應(yīng)。以上研究結(jié)果顯示了CCK-8抗炎作用的良好前景。 目前，有關(guān)CCK-8抗炎作用的受體及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。CCK-8的抗炎作用是通過其受體介導(dǎo)的。既往發(fā)現(xiàn)使細(xì)胞內(nèi)cAMP增加的物質(zhì)可抑制NF-κB活性，減少巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，可見cAMP-PKA信號(hào)通路的活化可抑制炎癥反應(yīng)。在消化系統(tǒng), CCK可激活cAMP-PKA通路和DAG-PKC通路，并且CCK可引起腹腔巨噬細(xì)胞cAMP含量增加而PKC活性降低，表明cAMP-PKA、DAG-PKC兩條途徑之間存在著互相抑制的cross-talk。在肺組織，有CCK-A和CCK-B兩種受體亞型表達(dá)，但在PIMs，CCK受體的表達(dá)亞型是什么？其結(jié)合特性怎樣？在信號(hào)傳遞過程中，CCK-8在NF-κB上游是通過哪條通路起作用的？目前未見相關(guān)報(bào)道。 本課題從CCK受體入手，研究CCK受體在PIMs上的表達(dá)亞型和結(jié)合特性，并探討CCK受體-cAMP-PKA-NF-κB這條信號(hào)通路及其與DAG-PKC通路間的cross-talk，以期闡明CCK-8的抗炎作用機(jī)制。 1 大鼠PIMs CCK受體的表達(dá)亞型及結(jié)合特性 CCK具有一定的抗炎作用，其發(fā)揮生理功能是通過受體介導(dǎo)的。根據(jù)其對(duì)內(nèi)源性CCK-8和胃泌素親和力的不同，CCK受體主要分為CCK-A和CCK-B兩種亞型，在體內(nèi)分布十分廣泛，但在大鼠PIMs，CCK受體的表達(dá)亞型和結(jié)合特性尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了探討。SD大鼠10只，隨機(jī)分為兩組。實(shí)驗(yàn)組舌靜脈注射5g·L-1的LPS 5 mg·kg-1，對(duì)照組注射等量生理鹽水。用酶消化法結(jié)合肺泡耗竭灌洗和肺循環(huán)灌洗技術(shù)分離純化大鼠PIMs，超速離心法提取細(xì)胞膜，與3H標(biāo)記的硫酸化CCK-8（3H-CCK-8S）進(jìn)行放射配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)，觀察正常大鼠和LPS誘導(dǎo)48h后的大鼠PIMs膜與3H-CCK-8S的結(jié)合情況，觀察孵育時(shí)間和溫度對(duì)特異性結(jié)合的影響。并在最佳條件下制備膜受體與配基結(jié)合的飽和曲線，觀察CCK受體的結(jié)合特性。用非標(biāo)記的CCK-8S、CCK-A受體特異性拮抗劑CR-1409及CCK-B受體特異性拮抗劑CR-2945進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)，觀察CCK受體表達(dá)亞型。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( ±s)表示。3H-CCK-8S與膜結(jié)合的平衡解離常數(shù)（KD）和最大結(jié)合容量（Bmax）由Scatchard作圖法經(jīng)直線回歸方程求得。CCK-8S和CR-1409及 CR-2945的IC50值由對(duì)數(shù)-幾率單位法求得。結(jié)果顯示：正常大鼠PIMs未能檢出特異性結(jié)合， WP=7 靜脈注射LPS 48h出現(xiàn)特異性結(jié)合，且對(duì)孵育時(shí)間和溫度有依賴性，在37℃和21℃孵育條件下，3H-CCK-8S能夠與膜迅速結(jié)合，30min可達(dá)平衡，但解離速度較快；而4℃孵育時(shí)，3H-CCK-8S與膜的特異性結(jié)合穩(wěn)步升高，于3h達(dá)到平衡狀態(tài)且不易解離，4℃孵育12h特異性結(jié)合仍然維持在平衡狀態(tài)。經(jīng)Scatchard分析，平衡解離常數(shù)KD值為：0.68±0.28nmol·L-1，最大結(jié)合容量Bmax值為32.50±2.70fmol·mg-1蛋白。在競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)中，3H-CCK-8S與大鼠PIMs膜的結(jié)合可被CCK-8S、CR-1409和CR-2945所抑制，當(dāng)拮抗劑濃度由10-12mol·L-1逐漸增加至10-6mol·L-1時(shí)，特異性結(jié)合進(jìn)行性下降，呈劑量依賴關(guān)系。其IC50值分別為：2.30±0.80nmol·L-1、3.20±1.13nmol·L-1和0.19±0.06μmol·L-1。在所有的結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，非特異性結(jié)合量占總結(jié)合量的
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2790429