發(fā)布時(shí)間：2020-08-12 02:29

【摘要】：自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cells, NK cells)是固有免疫系統(tǒng)中最重要的組成部分,也參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。NK細(xì)胞通過釋放細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞毒活性等方式在抵抗病毒和其他病原體感染早期以及殺傷腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。人的NK細(xì)胞由CD34+造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)發(fā)育而來,HSCs主要存在于骨髓中；臍血、外周血、胸腺、二級(jí)淋巴器官、肝臟以及蛻膜組織來源的HSCs在體外實(shí)驗(yàn)中也可以誘導(dǎo)出NK細(xì)胞,這表明NK細(xì)胞的終端分化不僅僅存在于骨髓中。NK細(xì)胞的發(fā)育成熟需要經(jīng)過一系列有序的階段,但我們對(duì)未成熟和成熟NK細(xì)胞的分子特征及轉(zhuǎn)錄調(diào)控知之甚少。目前,關(guān)于小鼠NK細(xì)胞研究報(bào)道較多,而對(duì)人NK細(xì)胞的全面理解尚未實(shí)現(xiàn)。 在人外周血中,NK細(xì)胞約占淋巴細(xì)胞總數(shù)的10%,在這些外周血NK細(xì)胞(peripheral NK, pNK)中有約95%為CD56dimCD16+成熟的NK細(xì)胞；與此不同的是,NK細(xì)胞是正常妊娠期間蛻膜組織中占主導(dǎo)地位的淋巴細(xì)胞(約占淋巴細(xì)胞總數(shù)的70%),這些早孕蛻膜NK(decidual NK, dNK)細(xì)胞主要為CD56brightCD16-未成熟的NK細(xì)胞。為了進(jìn)一步確認(rèn)pNK細(xì)胞相對(duì)于dNK細(xì)胞更為成熟,我們分析了轉(zhuǎn)錄因子T-bet和ID2的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子T-bet在最后階段調(diào)節(jié)小鼠NK細(xì)胞的終端成熟和功能；ID2表達(dá)于NK細(xì)胞的祖細(xì)胞,并調(diào)節(jié)其早期發(fā)育過程。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn),dNK細(xì)胞多為T-bet-,而90%的pNK細(xì)胞呈現(xiàn)T-bet+的表型。免疫印跡分析表明,ID2在dNK細(xì)胞中的表達(dá)量高于pNK細(xì)胞。此外,我們還檢測(cè)了許多已報(bào)道的與NK細(xì)胞發(fā)育、成熟相關(guān)的標(biāo)志分子的表達(dá),與預(yù)想結(jié)果一致,我們發(fā)現(xiàn)dNK細(xì)胞高表達(dá)許多不成熟的標(biāo)志分子(如CD27和CD94),而pNK細(xì)胞則高表達(dá)許多成熟的標(biāo)志分子(如CD57和CDllb)。綜上,我們的這些結(jié)果表明,dNK細(xì)胞相對(duì)于pNK細(xì)胞表現(xiàn)出相對(duì)未成熟的特征。 為了更好的發(fā)現(xiàn)人的未成熟和成熟NK細(xì)胞的新的分子特征以及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,我們以外周血CD56+T細(xì)胞和CD3+CD56-T細(xì)胞作為對(duì)照,對(duì)純化的dNK、臍血NK(cord-blood NK cell, cNK)和pNK細(xì)胞進(jìn)行了全基因組表達(dá)譜分析。通過高通量芯片以及熒光定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證的數(shù)據(jù),我們對(duì)未成熟的早孕蛻膜NK (immature decidual NK, idNK,表型為CD56brightCD16-T-bet-)和相對(duì)成熟的外周血NK(mature peripheral NK, mpNK,表型為CD56dimCD16+T-bet+)細(xì)胞做了全面的比較分析。我們不僅研究了未成熟NK和成熟NK細(xì)胞之間的差異,還分析了NK細(xì)胞相對(duì)于T細(xì)胞所共有的分子。 首先,我們比較了idNK和mpNK細(xì)胞表面分子表達(dá)的差異,我們發(fā)現(xiàn)這些差異與它們各自的已知功能是一致的。idNK細(xì)胞表達(dá)更多的抑制性受體(例如NKG2A、CD158b和GITR),可能與它們的較弱的細(xì)胞毒活性和維持自身耐受相關(guān)；而mpNK細(xì)胞表達(dá)多種活化性受體和共刺激因子(例如CD2、CD8和CD226),可能與它們對(duì)病原體感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)細(xì)胞毒活性相關(guān)。 其次,我們分析了生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子以及這些分子的受體在idNK和mpNK細(xì)胞的表達(dá)水平的異同。我們發(fā)現(xiàn),NK細(xì)胞可以分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein2, BMP2)、Jagged2和骨橋蛋白(osteopontin, OPN)等多種生長(zhǎng)因子,而這些分子已經(jīng)被報(bào)道可以影響NK細(xì)胞的發(fā)育,這就說明這些分子除了以旁分泌的方式發(fā)揮作用外還可能以自分泌的方式影響NK細(xì)胞的發(fā)育或功能。此外,值得注意的是,我們發(fā)現(xiàn),與mpNK細(xì)胞相比,idNK細(xì)胞表達(dá)很高水平的與破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞發(fā)生密切相關(guān)的生長(zhǎng)因子(例如Tnfsf11、Tnfrsfllb、Spp1和Bmp2)。 再次,我們發(fā)現(xiàn),idNK細(xì)胞內(nèi)很多趨化因子的mRNA (例如Xcll、Cxcll、 Cxcl10和Cxcl14)表達(dá)水平較高,這賦予idNK細(xì)胞更強(qiáng)的招募NK細(xì)胞自身或其他淋巴細(xì)胞的能力,例如招募未成熟的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)和中性粒細(xì)胞等。與idNK細(xì)胞富含趨化因子基因不同,mpNK細(xì)胞相對(duì)高表達(dá)多種趨化因子受體(例如CXCR4、CXCR2、CXCR1和CCR6),這表明mpNK細(xì)胞可能比idNK細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力。 緊接著,我們分析了不同NK細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)譜。我們的研究描述了人類不同的NK細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄因子,這些NK細(xì)胞亞群包括未成熟的NK細(xì)胞(dNK和CD56brightpNK細(xì)胞)和相對(duì)成熟的NK細(xì)胞(CD56dimpNK和CD34+HSCs體外誘導(dǎo)的NK細(xì)胞)。我們發(fā)現(xiàn),idNK和mpNK細(xì)胞分別富含同源異形框家族的轉(zhuǎn)錄因子(例如Hoxa5、Hoxa9、Pbx1和Hop)和鋅指蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子(例如Klf9、Znf143、Znf483和Znf831)。我們推測(cè)idNK細(xì)胞高表達(dá)的同源異形框家族的轉(zhuǎn)錄因子可能有助于維持其不成熟的細(xì)胞狀態(tài),而mpNK細(xì)胞高表達(dá)的鋅指蛋白可能對(duì)其細(xì)胞毒活性非常重要。此外,通過與T細(xì)胞的比較分析,我們發(fā)現(xiàn)了許多新的可能調(diào)節(jié)NK細(xì)胞發(fā)育或功能的轉(zhuǎn)錄因子。迄今,小鼠NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子相對(duì)明確,我們的研究發(fā)現(xiàn)許多小鼠模型發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子同樣也表達(dá)在人類的NK細(xì)胞中(例如Id2、Nfil3、Eomes、Mitf和Klf4)。除了確認(rèn)了上述小鼠中已知的轉(zhuǎn)錄因子,我們還發(fā)現(xiàn)了許多新的轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的發(fā)育和功能(例如Etv5、Nfe2、Mycn、Nr2f2和Hoxa10)。 最后,根據(jù)我們的研究數(shù)據(jù),并結(jié)合已有的報(bào)道以及生物信息學(xué)的分析結(jié)果,我們對(duì)針對(duì)性選擇的轉(zhuǎn)錄因子的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè),并提出了一個(gè)NK細(xì)胞的自我調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。我們推斷,造血干細(xì)胞發(fā)育過程中,NK細(xì)胞自分泌和/或旁分泌細(xì)胞因子和趨化因子誘導(dǎo)或激活了轉(zhuǎn)錄因子,反過來,轉(zhuǎn)錄因子又可以激活或促進(jìn)對(duì)NK細(xì)胞發(fā)育和成熟至關(guān)重要的分子的表達(dá)。這可能是成熟的具有功能的NK細(xì)胞產(chǎn)生的潛在機(jī)制。此外,我們強(qiáng)調(diào)自分泌的BMP2和TGF-β2和它們所調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子(如骨保護(hù)素/OPG,骨橋蛋白/OPN和多效生長(zhǎng)因子/PTN)以及idNK細(xì)胞中富含的轉(zhuǎn)錄因子(如同源盒家族轉(zhuǎn)錄因子、CREB和MYCN)相互協(xié)調(diào),相互作用,可能有助于維持idNK細(xì)胞的不成熟狀態(tài)。 我們的研究的創(chuàng)新之處和意義主要在于： (1)我們發(fā)現(xiàn)了一些新的idNK細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子,這些分子可能以自分泌的方式在NK細(xì)胞發(fā)育的早期及維持其不成熟的狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。有趣的是,這些生長(zhǎng)因子包括6個(gè)(如護(hù)骨素和多效生長(zhǎng)因子等)對(duì)骨形成和發(fā)育非常重要的分子,我們將NK細(xì)胞的功能拓展到一個(gè)全新的領(lǐng)域。 (2)我們首次描述了人的未成熟和成熟NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子譜。我們發(fā)現(xiàn),未成熟的蛻膜NK細(xì)胞富含同源異型盒家族的轉(zhuǎn)錄因子,可能有助于維持其不成熟的狀態(tài)；成熟的外周血NK細(xì)胞富含鋅指蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子,可能有助于發(fā)揮其細(xì)胞毒活性。 (3)NK細(xì)胞自分泌的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子和其表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用,形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。我們的研究較為全面的描述了NK細(xì)胞的自我調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 (4)通過與T細(xì)胞綜合比較分析,我們發(fā)現(xiàn)了許多新的可能參與調(diào)控NK細(xì)胞發(fā)育、分化或功能轉(zhuǎn)錄因子。 總體而言,我們的研究從細(xì)胞發(fā)育和分化的角度對(duì)未成熟和成熟NK細(xì)胞進(jìn)行了描述。我們較為詳細(xì)的分析了人NK細(xì)胞的表面受體、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子以及轉(zhuǎn)錄因子等分子特征并預(yù)測(cè)了NK細(xì)胞的自我調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。我們發(fā)現(xiàn)的新的轉(zhuǎn)錄因子和其下游靶基因可以讓人們更好地了解NK細(xì)胞的發(fā)育及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò),有助于控制NK細(xì)胞數(shù)量和功能,使其更好的應(yīng)用到臨床治療中。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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2 楊q

本文編號(hào)：2789914