【摘要】： 當(dāng)前，血吸蟲病仍然是嚴(yán)重危害人類健康和生命的主要寄生蟲病種。在防治策略上，以吡喹酮化療為主，結(jié)合藥物滅螺、有螺環(huán)境改造和健康教育的綜合性防治措施取得明顯效果。但在廣大的江湖洲灘地區(qū)，因環(huán)境復(fù)雜，滅螺成本高，人畜活動(dòng)頻繁，控制血吸蟲病的傳播上缺乏十分有效的手段。加之流行區(qū)血吸蟲再感染的反復(fù)發(fā)生，現(xiàn)行的控制措施明顯不能滿足防治形勢的需要，迫切要求新的措施介入。因此，血吸蟲病疫苗研究及可為疫苗研究提供有益線索的血吸蟲感染免疫和免疫病理機(jī)制的研究，備受關(guān)注。 在對(duì)血吸蟲感染免疫和免疫病理機(jī)制獲得不斷深入認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，繼續(xù)尋找新的具免疫保擴(kuò)作用的疫苗候選分子，是血吸蟲病疫苗研究工作的重要內(nèi)容。大量的血清流行病學(xué)資料和實(shí)驗(yàn)室研究的證據(jù)表明，血吸蟲特異性IgE抗體在抗血吸蟲感染免疫中發(fā)揮重要作用。在此基礎(chǔ)上提出的發(fā)展以誘導(dǎo)特異性IgE抗體應(yīng)答的血吸蟲病疫苗的研究策略，具有充分的現(xiàn)實(shí)可行性。為此，本研究首先從日本血吸蟲成蟲cDNA文庫中篩選和克隆血吸蟲特異性IgE抗體相關(guān)蛋白編碼基因，再亞克隆入表達(dá)質(zhì)粒載體并實(shí)現(xiàn)原核表達(dá)。接著通過生物信息學(xué)分析，獲得核苷酸及其編碼蛋白的組成、結(jié)構(gòu)和同源性的相應(yīng)資料。進(jìn)一步對(duì)純化的原核表達(dá)蛋 南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 蛋白的免疫原性、誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答的特征及其在抗血吸蟲攻擊 感染中的免疫保護(hù)作用和對(duì)肝蟲卵肉芽腫形成和肝纖維化的影 響，以及誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體在體外通過AmC效應(yīng)的殺血吸 蟲童蟲機(jī)制等方面進(jìn)行試驗(yàn)和觀察，并結(jié)合該蛋白分子在血吸蟲 體內(nèi)的分布特征，以綜合評(píng)價(jià)其在抗血吸蟲感染免疫中的作用和 意義。本研究還對(duì)日本血吸蟲特異性 IgE抗體相關(guān)肽表位誘導(dǎo)免 士 疫應(yīng)答的特征及在抗血吸蟲感染保護(hù)性免疫中的作用，進(jìn)行了初 步的試驗(yàn)觀察。研究內(nèi)客包括以下方面： 一．日本血吸蟲特異性 IgE抗體相關(guān)抗原編碼基因的克隆 ABC斗L SA法從日本血吸蟲病流行區(qū)居民中篩選具高水平抗 日本血吸蟲成蟲抗原 IgE抗體的個(gè)體，采血并分離血清。將混合 血清用Proteil。G柱吸。1丈以去除乃G型干擾抗體后，用于日本血 吸蟲成蟲 CDNA文庫的免疫學(xué)篩選；用羊抗人 IgE抗體二抗以保證 篩選獲得乃非抗體的特異性克隆。F巳性克隆插入片段經(jīng)KR擴(kuò)增， 用于nA序歹。J測定。jNIJ序結(jié)果顯示，該插入片段為1200 hP，第 一開讀框長507 hP，編碼169個(gè)氨基酸殘基，理論分子量為19．3 kDI。該M八序列與已知血吸蟲基固序列相寸 性小于4 0％，初步提 示為新的日本血吸蟲蛋白編碼序列，命名為Sj43B。于插入片段 兩側(cè)重新設(shè)計(jì)引物并 5］入 ECOR和 NO ti位點(diǎn)，將其先克隆入 PGME丁載體；重復(fù)測序結(jié)果與KR產(chǎn)物測序相同，再亞克隆入表 達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒Sj扔B沖GEX乃P十。n IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)物 沉淀中于約45 kDa處顯見高合蛋白表達(dá)帶，Western blot分析 表明，該蛋白帶可被篩庫血清中特異性lgE抗體識(shí)別；而載體本 身表達(dá)的26 GST蛋白帶則否。表明通過免疫學(xué)篩選和基因重組表 達(dá)，獲得了血吸蟲特異性 IgE抗體相關(guān)蛋白。 借助現(xiàn)行生物信息學(xué)分析手段，通過互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)入GenBank數(shù) 據(jù)庫，對(duì)Sj43B與已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)，應(yīng)用 DNAtOOIS軟件 對(duì)其編碼蛋白序列的氨基酸紐成、親水性、抗原性和可及性進(jìn)行 分析，并在 blastp程序下在 GenBank蛋白數(shù)據(jù)庫中對(duì) Sj43B編碼 －3－ 人卞醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)杠論文 蛋白進(jìn)行同源性檢索。結(jié)果顯示，Sj43B基因核菩酸序列與己知 序歹J的 Scores分值均。J、＋ 200，提示 Sj43B為一新的蛋白編碼序 列。該基因編碼蛋白的等電點(diǎn)是5．89，其親水性、抗原性和可及 性分布曲線基本一致，預(yù)測抗原表位分另IJ在第 2 5－3 5位、7 5－8 2 位、1H－1們位、117－1n位和 149－159位氨基酸殘基。蛋白 同源性分析顯示，Sj43B編碼蛋白與來自人和＊、鼠的含洲3結(jié)構(gòu) ‘域蛋白的同源性為3洲。這一結(jié)果對(duì)提示該蛋白可能的功能作用， 具有重要的參考價(jià)值。 H．Sj43B／PGEX－6P－1重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物的鄉(xiāng)寸 和 免疫學(xué)性質(zhì)鑒定分析 為獲得可溶性的 rsj43B月6 GST A蟲合蛋白，對(duì)不同 IPTG誘導(dǎo) 劑濃度、誘導(dǎo)表達(dá)溫度和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間等因素對(duì)融合蛋白可溶性 表達(dá)的影響進(jìn)行了觀察。結(jié)果顯示，在 k 05 flllllO UL一 2．0 mmo UL 的IPTG濃度、15C－37C誘導(dǎo)表達(dá)溫度和lh－4 11誘導(dǎo)表達(dá)時(shí) 間范圍內(nèi)，改變相應(yīng)條件對(duì)重組蛋白的可溶性表
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

的鑒定選擇性培養(yǎng)獲得的白斑中提酶切后，電泳顯示一約55，表明pGME一T質(zhì)粒重組成功一1的鑒定Notl雙酶切表達(dá)載體pGEX應(yīng)后的轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21Notl雙酶切出約550bP隆入表達(dá)載體pGEX一6p一1。bP1234

沉淀中于約45kDa處有一特征性高表達(dá)融合蛋白條帶，含空載質(zhì)粒的對(duì)照菌則表達(dá)載體本身的日本血吸蟲26kDaGsT蛋白(圖4)，而重組菌裂解物的上清中則無此融合蛋白條帶，提示重組基因表達(dá)產(chǎn)物可能是以不溶性包涵體形式存在。we5ternbl。t結(jié)果顯示，重組菌于45kDa處的表達(dá)條帶，可被篩庫血清中血吸蟲特異性工gE杭體識(shí)別，正常人血清對(duì)其不識(shí)別�？蛰d質(zhì)粒的對(duì)照菌表達(dá)的26kDaGST條帶，不被特異性IgE抗體識(shí)別。見圖5。123kDa融合蛋白fUSioflProtein圖4表達(dá)產(chǎn)物的聚丙烯酞胺凝膠電泳1重組質(zhì)粒載體表達(dá)菌2蛋白標(biāo)志物3空載質(zhì)粒/宿主菌丑coj，’BLZIF19.Lane4SDS一PAGEoftheexPressedProductsofeloneSj43BPlasmidPlasmidLane2Protein

5.表達(dá)產(chǎn)物的we5ternbl。t鑒定重組表達(dá)菌2蛋白標(biāo)志物3質(zhì)粒載體4空載19.5WesternblotanalysisoftheexPresanel丑co/jBL21withrecombinantPlasmidLane3及colj/PGEX一6P一1Lane4E.cojjBL21w

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本文編號(hào)：2789610