【摘要】：幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是革蘭氏陰性的微需氧菌。在世界范圍內(nèi)，其人群感染率達50％以上。H. pylori為胃、十二指腸潰瘍的主要病原，與胃癌、胃黏膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤密切相關(guān)，已被世界衛(wèi)生組織列為與胃癌發(fā)生相關(guān)的Ⅰ類病原。目前控制H. pylori的感染主要進行H. pylori根治性治療，主要治療方案為聯(lián)合應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑和抗生素的療法。雖然獲得較好的療效，仍然存在下列問題：如患者對藥物的依從性、抗生素耐藥菌株不斷出現(xiàn)、再感染的發(fā)生及藥物的不良反應(yīng)如腹痛、惡心、嘔吐，這都可能使臨床藥物治療受到限制，另外，藥物治療僅針對有癥狀的患者，而無癥狀的H. pylori攜帶者仍存在發(fā)展為慢性胃炎甚至胃癌的危險性。如何在廣大人群中有效控制H. pylori感染，并遏制感染后的一系列相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。有效的預(yù)防性和治療性H. pylori疫苗可以克服上述藥物根治治療H. pylori的不足之處，被認(rèn)為是控制H. pylori感染的最有前景的方法。 核酸疫苗分為DNA和RNA疫苗，主要指DNA疫苗。DNA疫苗是繼減毒、滅活和亞單位疫苗之后的第3代疫苗，通常由編碼病原或腫瘤細(xì)胞的質(zhì)粒DNA分子構(gòu)成。DNA疫苗接種后，機體細(xì)胞攝取DNA，并在細(xì)胞中表達所編碼的抗原。DNA疫苗作為一項新型免疫技術(shù)和傳統(tǒng)疫苗包括滅活、減毒和亞單位疫苗相比，具有顯著的優(yōu)勢：和大多數(shù)亞單位疫苗不同，DNA疫苗可以刺激機體同時產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫，而體液免疫和細(xì)胞免疫對獲得免疫預(yù)防和免疫治療作用至關(guān)重要。雖然傳統(tǒng)的減毒疫苗也可刺激機體同時產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，但此疫苗存在安全隱患，可能由減毒狀態(tài)回復(fù)至毒性狀態(tài)，而DNA疫苗則無此危險性。DNA疫苗通過基因工程技術(shù)制造，可對基因進行修飾，制作相對簡單，疫苗本身為具有熱穩(wěn)定性的重組質(zhì)粒，無需特別純化。另外，尚有報道DNA疫苗可刺激產(chǎn)生長久的免疫作用。 DNA疫苗已被廣泛用于動物實驗和非人類的靈長類動物，可刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。DNA疫苗免疫逐漸成為病毒、細(xì)菌和寄生蟲等病原的極具前景的治療方法。動物實驗已經(jīng)證實DNA疫苗對HIV病毒、流感 第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要 病毒、狂犬病毒、瘧疾、結(jié)核桿菌等具免疫保護作用。臨床實驗也顯示DNA 疫苗的安全性和良好的耐受性。然而目前對H刃tori疫苗的研究還大多采用 全菌超聲裂解物或單個保護性抗原蛋白疫苗和佐劑如霍亂毒素或熱穩(wěn)定性大 腸桿菌腸毒素，該類疫苗制作較復(fù)雜，免疫佐劑尚具較大的胃腸道毒性。 目前被廣泛應(yīng)用的免疫佐劑大多可刺激機體產(chǎn)生非特異性免疫反應(yīng)，然而 由于存在的較大毒性，使其難以用于人類臨床。細(xì)胞因子如IL一2、IL一4、IL一12、 IFN一Y已被證實可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，一些研究證實，在疫苗接種的同時攝入細(xì) 胞因子蛋白作為佐劑，或者接種表達細(xì)胞因子的質(zhì)�？梢蕴岣呋蛘{(diào)節(jié)機體對 DNA疫苗的免疫應(yīng)答，而至今，大多數(shù)研究都通過和病毒抗原或腫瘤相關(guān)抗 原疫苗共同免疫來證實細(xì)胞因子的佐劑作用，而細(xì)胞因子佐劑在H Pylori.疫 苗的免疫調(diào)節(jié)作用尚未見報道。 活的減毒細(xì)菌載體如減毒沙門氏菌系統(tǒng)被證實為有效的疫苗載體工具，體 外研究表明該菌可把DNA疫苗運輸?shù)饺梭w細(xì)胞，并在體內(nèi)的感染和腫瘤動物 模型被證實。減毒沙門氏菌可使疫苗通過豁膜表面接種，以勃膜相關(guān)淋巴組織 中的抗原遞呈細(xì)胞為靶細(xì)胞，最終刺激產(chǎn)生局部和全身免疫反應(yīng)，使機體獲得 免疫保護。 本研究擬構(gòu)建以減毒沙門氏菌為載體、UreB或HpaA為保護性抗原、IL一2 為免疫佐劑的核酸疫苗，并檢測其預(yù)防性和治療性免疫保護作用。 1構(gòu)成核酸疫苗的重組質(zhì)粒的構(gòu)建 目的:構(gòu)建編碼H刃tori ureB及飾aA基因及小鼠IL一2基因的核酸疫苗 重組質(zhì)粒。 方法:抽提HPylori基因組DNA，應(yīng)用PCR技術(shù)分別擴增ureB及hPaA 基因片斷;從重組質(zhì)粒pCIneo一工L一2擴增IL一2基因，分別克隆入puCmT載 體，檢測ureB、hpaA、IL一2基因序列，經(jīng)過酶切、連接反應(yīng)將測序后的上述 基因片斷其克隆入真核表達載體PIRES，并導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌DHS“，篩 選陽性克隆，通過PCR和酶切反應(yīng)鑒定。 結(jié)果:分別擴增出約一700bp的ureB基因、75obp的hpaA和slobp的IL一2， 測序結(jié)果表明擴增出的ureB、hpaA、IL一2基因與基因庫公布的序列一致，PCR 和酶切鑒定結(jié)果證實上述基因克隆入真核表達載體PIRES，成功構(gòu)建了核酸疫 苗的重組質(zhì)粒pIRES一ureB、PIRES一ureB一IL一2、PIRES一hPaA一IL一2。 第二軍醫(yī)大學(xué) 博士學(xué)位論文 中文摘要 結(jié)論:構(gòu)建了編碼H刃l(wèi)ori ureB和hPaA基因及小鼠IL一2基因的重組質(zhì) 粒，為進一步探索其體內(nèi)外免疫性奠定了基礎(chǔ)。 2重組質(zhì)粒體外免疫原性的檢測 目的:檢測重組質(zhì)粒pIRES一ureB、pIRES一ureB一IL一2、pIRES一hpaA一IL一2 體外的免疫原性。 方法:采用Qiagen Plasmid Midi Kits大量抽提重組質(zhì)粒pIRES一ureB、 pxREs一ureB一IL一2、pIREs一hpaA一IL一2，通過脂質(zhì)體Lip。feetam一neTMZ000把重 組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的COS--7細(xì)胞，采用聚丙烯酞胺凝膠電泳和免疫印跡法檢 測pIRES一ureB、pIRES一ureB一IL一2、p
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R392
【圖文】：

2.IPCR擴增目的基因以HPytori基因組DNA為模板，進行ureB基因擴增，產(chǎn)物于1一1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見1700bp左右的擴增產(chǎn)物，見圖1一1;以HPytori基因組DNA為模板，進行hpaA基因擴增，結(jié)果可見75Obp左右的擴增產(chǎn)物，見圖1一2;以pC工ne。一工L一2質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增，結(jié)果可見51Obp左右的擴增產(chǎn)物結(jié)果見圖1一3。圖1一1ureB基因PeR擴增結(jié)果Lanel:空白對照;laneZ一3:ureB擴增產(chǎn)物:lane4:DNAMarker(DL2000+15000)圖1一2hpaA基因PCR擴增結(jié)果Lanel:DNAMarkerDL2000;laneZ，4:hpaA的擴增產(chǎn)物;Lane3:空白對照圖1一3質(zhì)粒pCIneo一IL一2的PCR擴增lanel，4:空白對照;Lane3:DNAMarker(DL2000+15000);LaneZ:質(zhì)粒的IL一2的PCR擴增產(chǎn)物2.2PCR擴增產(chǎn)物測序分析結(jié)果由上海申友生物技術(shù)有限公司及上海申能博采生物技術(shù)有限公司對克隆入T載體的PCR產(chǎn)物進行測序

2.3.2pIRES一ureB及pIRES一ureB一IL一2重組質(zhì)粒鑒定pIRES一ureB經(jīng)Nhel和Xhol雙酶切，可見1700bp的ureB片斷和6.Ikb的pIRES片斷，見圖1一7;以pIRES一ureB為模板可擴增出1700bp的ureB基因片斷，見圖1一8;pIRES一ureB經(jīng)Nhel和Notl雙酶切可得5.44kb和2.36kb(包含盯eB+IRES序列)的片斷，見圖1一11，以上均證實重組質(zhì)粒p工RES一ureB的成功構(gòu)建。pIRES一ureB一IL一2經(jīng)Nhel和Xhol雙酶切可得1700bp的ureB片斷和6.6kb的pIRES一IL一2片斷，見圖1一9;pIRES一ureB一IL一2PCR反應(yīng)可獲得1700bp的ureB產(chǎn)物和510bpIL一2產(chǎn)物，經(jīng)Nhel和Xhol雙酶切可得1700bp的ureB片斷，而經(jīng)Sall和Notl雙酶切可得到510bp的IL一2片斷，見圖1一10。經(jīng)Nhel和Notl雙酶切可得5.44kb和2.87kb(含ureB+IRES+IL一2序列)片斷

Lanel:vUCmT一ureB為陽性對照;LaneZ:陰性對照;Lane3一4:pIRES一ureB;Lsnes:DL2000DNAMsrker圖1一9圖1一10圖1一9pIRES一ureB一IL一2Nhel和Xhol雙酶切鑒定Lanel一2:pIRES一ureB一IL一2不同克隆雙酶切鑒定圖;Lane3:入一HindlllDNAMarker圖1一10pIRES一ureB一IL一2雙酶切和PCR鑒定Lanel:PCR陰性對照;LaneZ:pIRES質(zhì)粒;Lane3:pIRES一ureB一IL一2經(jīng)Nhel和XhoI雙酶切;Lane4:pIRES一ureB一IL一2擴增的ureB產(chǎn)物;Lanes:pIRES一ureB一IL一2經(jīng)撇1I和NOrl雙酶切;Lane6:pIRES一ureB一IL一2擴增的IL一2產(chǎn)物;Lane7:DNAMarker(DL2000+15000);Lanes:PCR陰性對照圖1一11pIRES一ureB一IL一2和pIRES一ureBNhel和Notl雙酶切鑒定Lanel:pIRES一ureB雙酶切鑒定圖(5.44kb+1.7kb+660bp);LaneZ:pIRES一ureB一IL一2雙酶切鑒定圖(5.44kb+1.7kb+510bp+660bp);Lane3:IkbDNAMarker2.3.3pIRES一hpaA一IL一2重組質(zhì)粒的鑒定pIRES一hpaA一IL一2質(zhì)粒EeoRI+Mlul雙酶切電泳結(jié)果如圖1一12，可見

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 向淑利;DNA疫苗與脂質(zhì)體[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2001年07期

2 朱森林,陳e

本文編號：2787286