【摘要】：T淋巴細(xì)胞在免疫反應(yīng)中起著重要的作用，其中之一是細(xì)胞毒性反應(yīng)，即T淋巴細(xì)胞通過裂解作用殺傷表達(dá)特異性抗原的異常細(xì)胞。具有這種細(xì)胞毒性作用的T細(xì)胞的表面抗原大部分是CD_8陽性，被稱為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)。CTLs能夠清除機(jī)體內(nèi)病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染的細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞，也能在同種異體移植免疫反應(yīng)過程中起排斥作用。CTLs識別抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APCs)表面的MHC I類分子與抗原肽形成的復(fù)合體，目前已知與MHC I類分子結(jié)合的抗原肽無論來自腫瘤抗原或其它外源病原微生物抗原都是含8-11氨基酸的短肽，該短肽與MHC I類分子非共價結(jié)合，位于抗原遞呈細(xì)胞的表面，被CTLs表面的T細(xì)胞受體(T-cell receptor，TCR)識別而誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL反應(yīng)�？乖禺愋訡TLs的定量或定性檢測無論對臨床診斷、疫苗免疫或免疫抑制治療后進(jìn)行的療效評估都是至關(guān)重要的手段。 許多實驗室通過對TCR及其配體的研究發(fā)現(xiàn)它們之間的相互作用很弱(10~(-4)～10~(-7)M)，且解離速度很快，半衰期只有幾秒鐘，使得CTLs的檢測非常困難。目前體外檢測抗原特異性CTL反應(yīng)的方法主要有以下4種：(1)~(51)Cr釋放分析法；(2)檢測CTLs分泌的細(xì)胞因子法；(3)針對特異性TCR的PCR法：(4)利用可結(jié)合于TCR的熒光抗原標(biāo)記CTLs的可溶性MHC-肽四聚體分析法。由于前兩種方法需要在體外進(jìn)行細(xì)胞增殖培養(yǎng)，可因多種因素造成CTLs的檢測結(jié)果偏低，且檢測步驟復(fù)雜，臨床實用性差；第三種方法基于PCR技術(shù)，其敏感性高，但是僅僅局限于已知TCR基因型的特異性CTLs的檢測：最后一種四聚體分析法于近年來興起，已被較廣泛地應(yīng)用，是直接檢測抗原特異性CTLs的方法，該方法用四價MHC-肽復(fù)合物減慢了其與TCR的解離率，同時利用流式細(xì)胞儀技術(shù)大大增強(qiáng)了敏感性，但是仍然沒有從根本上克服解離率快這一限制CTLs檢測方法發(fā)展的關(guān)鍵問題。 在本研究中，我們設(shè)計了新的直接檢測人外周血抗原特異性CTLs的方法，
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號】：R392
【圖文】：

部分cDNA序列)和326bp分別用%l的瓊脂糖凝膠電泳(圖8)和1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析(圖9)。把上述PCR的純化產(chǎn)物連接到pGEM一TEASY載體上送測序;測序結(jié)果與從GENEBANK獲得的HLA一A*0201和pZmcNDA序列進(jìn)行比較，本實驗獲得的GNEEBANK中HLA一A*0201序列完全一致，HLA一A*0201部分cDNA序列與pZmeDNA序列的第75位堿基C突變?yōu)閠，考慮可能是由于密碼子的第三個堿基(tg旦響翻譯結(jié)果。CPR過程中引入的突變，但是，該突變恰巧是三連，tg上)，是同義突變，其編碼的氨基酸相同，不影

上述兩種PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后，可以進(jìn)行退火和延伸，再加入外側(cè)上、下游引物進(jìn)行再擴(kuò)增，獲得了86b4p大小的HLA一A*0201E58C突變cDNA序列，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析(圖13)，然后克隆在pGEM一TEASY載體上，送測序，測序結(jié)果與GENEBANK中的HLA一A*O20lcDNA序列相互比較，

突變引物c和HLA一A*0201外側(cè)下游引物d擴(kuò)增HLA一A*0201第55一第271位氨基酸的cDNA序列，分別得到202Pb和683Pb大小的兩種PCR產(chǎn)物，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析(圖12);由于中央突變引物之間存在著互補(bǔ)序列，上述兩種PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后，可以進(jìn)行退火和延伸，再加入外側(cè)上、下游引物進(jìn)行再擴(kuò)增，獲得了86b4p大小的HLA一A*0201E58C突變cDNA序列，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析(圖13)，然后克隆在pGEM一TEASY載體上，送測序，測序結(jié)果與GENEBANK中的HLA一A*O20lcDNA序列相互比較，

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2787437