【摘要】：T淋巴細胞在免疫反應中起著重要的作用，其中之一是細胞毒性反應，即T淋巴細胞通過裂解作用殺傷表達特異性抗原的異常細胞。具有這種細胞毒性作用的T細胞的表面抗原大部分是CD_8陽性，被稱為細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)。CTLs能夠清除機體內病毒、細菌和寄生蟲感染的細胞，殺傷腫瘤細胞，也能在同種異體移植免疫反應過程中起排斥作用。CTLs識別抗原遞呈細胞(antigen presenting cells，APCs)表面的MHC I類分子與抗原肽形成的復合體，目前已知與MHC I類分子結合的抗原肽無論來自腫瘤抗原或其它外源病原微生物抗原都是含8-11氨基酸的短肽，該短肽與MHC I類分子非共價結合，位于抗原遞呈細胞的表面，被CTLs表面的T細胞受體(T-cell receptor，TCR)識別而誘導產生CTL反應。抗原特異性CTLs的定量或定性檢測無論對臨床診斷、疫苗免疫或免疫抑制治療后進行的療效評估都是至關重要的手段。 許多實驗室通過對TCR及其配體的研究發(fā)現(xiàn)它們之間的相互作用很弱(10~(-4)～10~(-7)M)，且解離速度很快，半衰期只有幾秒鐘，使得CTLs的檢測非常困難。目前體外檢測抗原特異性CTL反應的方法主要有以下4種：(1)~(51)Cr釋放分析法；(2)檢測CTLs分泌的細胞因子法；(3)針對特異性TCR的PCR法：(4)利用可結合于TCR的熒光抗原標記CTLs的可溶性MHC-肽四聚體分析法。由于前兩種方法需要在體外進行細胞增殖培養(yǎng)，可因多種因素造成CTLs的檢測結果偏低，且檢測步驟復雜，臨床實用性差；第三種方法基于PCR技術，其敏感性高，但是僅僅局限于已知TCR基因型的特異性CTLs的檢測：最后一種四聚體分析法于近年來興起，已被較廣泛地應用，是直接檢測抗原特異性CTLs的方法，該方法用四價MHC-肽復合物減慢了其與TCR的解離率，同時利用流式細胞儀技術大大增強了敏感性，但是仍然沒有從根本上克服解離率快這一限制CTLs檢測方法發(fā)展的關鍵問題。 在本研究中，我們設計了新的直接檢測人外周血抗原特異性CTLs的方法，
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2001
【分類號】：R392
【圖文】：

部分cDNA序列)和326bp分別用%l的瓊脂糖凝膠電泳(圖8)和1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析(圖9)。把上述PCR的純化產物連接到pGEM一TEASY載體上送測序;測序結果與從GENEBANK獲得的HLA一A*0201和pZmcNDA序列進行比較，本實驗獲得的GNEEBANK中HLA一A*0201序列完全一致，HLA一A*0201部分cDNA序列與pZmeDNA序列的第75位堿基C突變?yōu)閠，考慮可能是由于密碼子的第三個堿基(tg旦響翻譯結果。CPR過程中引入的突變，但是，該突變恰巧是三連，tg上)，是同義突變，其編碼的氨基酸相同，不影

上述兩種PCR產物經過純化后，可以進行退火和延伸，再加入外側上、下游引物進行再擴增，獲得了86b4p大小的HLA一A*0201E58C突變cDNA序列，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析(圖13)，然后克隆在pGEM一TEASY載體上，送測序，測序結果與GENEBANK中的HLA一A*O20lcDNA序列相互比較，

突變引物c和HLA一A*0201外側下游引物d擴增HLA一A*0201第55一第271位氨基酸的cDNA序列，分別得到202Pb和683Pb大小的兩種PCR產物，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析(圖12);由于中央突變引物之間存在著互補序列，上述兩種PCR產物經過純化后，可以進行退火和延伸，再加入外側上、下游引物進行再擴增，獲得了86b4p大小的HLA一A*0201E58C突變cDNA序列，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析(圖13)，然后克隆在pGEM一TEASY載體上，送測序，測序結果與GENEBANK中的HLA一A*O20lcDNA序列相互比較，

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

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本文編號：2787437