【摘要】：湖南省位于我國(guó)長(zhǎng)江下游,夏季高溫多雨,適宜蚊蟲滋生和繁殖,從而利于蟲媒病毒傳播和擴(kuò)散。長(zhǎng)期以來(lái)湖南省是我國(guó)蟲媒傳染病—乙型腦炎的流行疫區(qū),特別是西部、南部的山區(qū)和丘陵區(qū)的乙型腦炎發(fā)病率一直較高。湖南省開展的登革熱血清學(xué)調(diào)查表明當(dāng)?shù)亟】等巳捍嬖诘歉锊《究贵w陽(yáng)性,提示當(dāng)?shù)卮嬖谝夷X以外蟲媒病毒性疾病的可能性。西藏自治區(qū)位于青藏高原西南部,與緬甸、印度、尼泊爾等國(guó)接壤,是我國(guó)西南邊陲的重要門戶。在藏東的高山峽谷區(qū),海拔較低,氣溫較高,濕度較大,適于蚊蟲滋生,對(duì)當(dāng)?shù)卣Ｈ巳旱难鍖W(xué)調(diào)查結(jié)果顯示人群中存在乙腦病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒等抗體陽(yáng)性,提示藏東地區(qū)可能存在蟲媒病毒的流行。伴隨西藏旅游業(yè)的發(fā)展和西部大開發(fā),將有大量人員和物資的來(lái)往和流動(dòng),可能會(huì)造成蟲媒病毒病的傳入和傳出、甚至爆發(fā)流行。因此,對(duì)湖南省和西藏自治區(qū)進(jìn)行蟲媒病毒病原學(xué)的調(diào)查,全面了解當(dāng)?shù)卮嬖诤脱h(huán)的蟲媒病毒種類與分布情況,對(duì)于研究我國(guó)蟲媒病毒生物學(xué)及分子生物學(xué)特征、預(yù)防和控制當(dāng)?shù)叵x媒病毒病等具有重要意義。 本課題對(duì)湖南省和西藏自治區(qū)開展蟲媒病毒病原學(xué)調(diào)查,以明確當(dāng)?shù)卮嬖诘南x媒病毒種類與分布,并對(duì)分離到的蟲媒病毒進(jìn)行詳細(xì)鑒定和序列特征分析,以了解這些新分離病毒株的系統(tǒng)分類地位、分子生物學(xué)特征及其與國(guó)內(nèi)外分離株間的分子生物學(xué)差異。 1.湖南省蟲媒病毒調(diào)查 本研究分別于2010和2011年的7-8月在湖南省懷化、張家界、岳陽(yáng)、郴州、湘潭、邵陽(yáng)、株洲和長(zhǎng)沙市的16個(gè)區(qū)縣采集蚊蟲標(biāo)本4屬7種16076只,按形態(tài)學(xué)分類分裝347批。蚊種包括庫(kù)蚊屬的致倦庫(kù)蚊、淡色庫(kù)蚊、三帶喙庫(kù)蚊、兇小庫(kù)蚊,按蚊屬的中華按蚊,阿蚊屬的騷擾阿蚊及伊蚊屬的白紋伊蚊。2年內(nèi)采集最多的蚊種為致倦庫(kù)蚊(8140只,50.63%),其次為中華按蚊(3900只,24.26%),采集最少的蚊種為白紋伊蚊(14只,0.09%)。蚊蟲標(biāo)本研磨后利用C6/36和BHK-21等細(xì)胞培養(yǎng)開展病毒分離,結(jié)果得到6株陽(yáng)性分離物。經(jīng)過(guò)系統(tǒng)鑒定,分別為2株乙腦病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、2株環(huán)狀病毒(Orbivirus)、2株病毒需要進(jìn)一步鑒定。6株分離物分別來(lái)自4個(gè)蚊種一致倦庫(kù)蚊、淡色庫(kù)蚊、三帶喙庫(kù)蚊和中華按蚊；致倦庫(kù)蚊分離病毒最多,為3株,其余3株由淡色庫(kù)蚊、三帶喙庫(kù)蚊和中華按蚊分離;并且3類病毒均能從致倦庫(kù)蚊中分離到。 2株乙腦病毒的分子生物學(xué)特征分析顯示,2株JEV均為基因Ⅰ型病毒,2株病毒間E基因核苷酸和氨基酸序列同源性為100%,與疫苗株P(guān)3、Beijing-1和SA14-14-2株在E基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為87.7-88.1%和97.2-98.2%。2株JEV與疫苗株SA14-14-2株在E基因區(qū)段存在14處的氨基酸差異,但差異位點(diǎn)均不處于決定抗原性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。2株JEV在E基因區(qū)段決定病毒毒力的8個(gè)氨基酸位點(diǎn)未見(jiàn)改變。 2株在湖南新分離的環(huán)狀病毒在致細(xì)胞病變效應(yīng)上,可引起B(yǎng)HK-21細(xì)胞病變；在PAGE電泳中,環(huán)狀病毒的帶型為3-6-1型；基于第1片段和第10片段基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,2株環(huán)狀病毒在進(jìn)化樹中具有相似的拓?fù)浣Y(jié)果,與家畜流行性出血熱病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus, EHDV)有較近的親緣關(guān)系,而與云南環(huán)狀病毒的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在湖南分離的2株環(huán)狀病毒與以往在蚊蟲中分離的云南環(huán)狀病毒不同,為環(huán)狀病毒屬的一種新病毒。 另外2株病毒可引起B(yǎng)HK-21細(xì)胞病變,空斑形成實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn)直徑約為3.0mm的空斑。利用針對(duì)黃病毒科、布尼亞病毒科、乙腦病毒、蓋塔病毒等特異引物的RT-PCR實(shí)驗(yàn)鑒定病毒為陰性結(jié)果；利用甲病毒缺陷性復(fù)制子鑒定未知病毒實(shí)驗(yàn)為陰性結(jié)果。以上結(jié)果初步排除這2株病毒為我國(guó)常見(jiàn)的蟲媒病毒種類,需要進(jìn)一步鑒定。 2.西藏自治區(qū)蟲媒病毒調(diào)查 2009年8月在西藏自治區(qū)林芝地區(qū)的墨脫縣和米林縣采集4089只蚊蟲,在墨脫縣采集的三帶喙庫(kù)蚊中分離到1株乙腦病毒(XZ0934株) 對(duì)XZ0934株的分子生物學(xué)特征分析表明,該病毒基因組全長(zhǎng)為10983nt;從第96-10397位是一個(gè)單一開放讀碼框(ORF),長(zhǎng)度為10302nt,編碼3433個(gè)氨基酸。乙腦病毒全基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,XZ0934株獨(dú)立于目前已知的4個(gè)基因型別的乙腦病毒之外,是基因Ⅴ型乙腦病毒。與目前已知的4個(gè)基因型別乙腦病毒全序相比,XZ0934株在開放讀碼框NS4a區(qū)段比其他乙腦病毒都要多3個(gè)核苷酸(AGC),相應(yīng)地多編碼1個(gè)氨基酸(絲氨酸)。XZ0934毒株在E基因區(qū)段決定病毒毒力的8個(gè)氨基酸位點(diǎn)未見(jiàn)改變；與疫苗株SA14-14-2株在E基因區(qū)段存在24處的氨基酸差異,其中E340位點(diǎn)的氨基酸突變可能會(huì)導(dǎo)致其抗原性的改變。采用貝斯馬爾科夫蒙特卡洛算法,構(gòu)建基于全世界100株乙腦病毒全基因組最大可信樹(Maximum clade credibility tree, MCC Tree)的結(jié)果顯示,乙腦病毒的最近共同進(jìn)化祖先出現(xiàn)于3255年前,5個(gè)基因型別的乙腦病毒進(jìn)化分歧時(shí)間按照Ⅴ,Ⅳ,Ⅲ,Ⅱ,Ⅰ的順序排列,基因Ⅴ型乙腦病毒最先從乙腦病毒種群中分化出來(lái),是最古老的乙腦病毒種系。 本課題的意義及創(chuàng)新性 本課題對(duì)湖南省和西藏部分地區(qū)進(jìn)行了蟲媒病毒調(diào)查,在湖南省分離到乙腦病毒和環(huán)狀病毒等,在西藏分離到乙腦病毒。在湖南省分離到基因Ⅰ型JEV屬國(guó)內(nèi)首次報(bào)道,同時(shí)發(fā)現(xiàn)湖南省分離的環(huán)狀病毒為環(huán)狀病毒屬的一種新病毒屬國(guó)際上首次報(bào)道。在西藏自治區(qū)分離到的基因Ⅴ型乙腦病毒是時(shí)隔57年后該基因型乙腦病毒的再次出現(xiàn),并在國(guó)際上首次利用生物信息學(xué)軟件推算出5個(gè)型別乙腦病毒的最近共同進(jìn)化祖先為3255年前。 這些研究數(shù)據(jù)不但豐富了我國(guó)湖南省、西藏自治區(qū)蟲媒病毒的種類,而且為了解當(dāng)?shù)貍魅静〔∫蛞约胺e極預(yù)防和控制相關(guān)蟲媒病毒疾病提供了重要的信息。對(duì)新分離到的JEV、環(huán)狀病毒等分離物的鑒定和分子生物學(xué)特征分析,明確了這些病毒的分類地位及其與國(guó)內(nèi)外分離株間的分子生物學(xué)差異,豐富了我國(guó)蟲媒病毒分子生物學(xué)研究?jī)?nèi)容,為深入研究我國(guó)存在和流行的蟲媒病毒積累了科學(xué)數(shù)據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2787149