【摘要】：隱球菌系環(huán)境腐生菌，常引起免疫功能低下人群的感染，隱球菌性腦膜炎/腦膜腦炎是其高病死率的最主要的原因。隱球菌感染一般有兩個結(jié)局，一是宿主免疫反應(yīng)清除隱球菌，另一個就是隱球菌成功逃逸機體的免疫應(yīng)答，從而造成潛伏感染或播撒。目前認為隱球菌逃逸機體的免疫殺傷有以下幾個途徑：1、“吞噬體擠出”與細胞內(nèi)復(fù)制；2、溶解巨噬細胞或誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡；3、避免被巨噬細胞吞噬；4、遮蓋病原體相關(guān)分子模式（PAMP），避免宿主免疫識別；5、誘導(dǎo)機體免疫抑制。 甘露糖受體（Mannose receptor，MR）也叫CD206，主要由巨噬細胞及樹突狀細胞表達，屬于C型凝集素樣受體，是一種模式識別受體，不僅可以識別并結(jié)合病原生物的多種糖蛋白，介導(dǎo)固有免疫應(yīng)答，而且通過其抗原提呈等功能，可以促進T細胞活化和細胞因子釋放，啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答。新生隱球菌甘露糖蛋白（Mannoprotein，MP）是MR的配體，MP可有效激活機體T細胞免疫應(yīng)答，增強小鼠的抗隱球菌感染免疫，表現(xiàn)在MP免疫小鼠可以延長其新生隱球菌感染后的生存時間和降低器官的真菌荷載，且DCs可以通過MR和FC受體吞噬隱球菌，進而遞呈抗原給T細胞，誘發(fā)機體的抗隱球菌免疫應(yīng)答。目前有關(guān)隱球菌逃逸機體免疫應(yīng)答的研究主要集中在隱球菌莢膜相關(guān)基因及隱球菌巨噬細胞內(nèi)復(fù)制，而對于隱球菌是否通過影響某些重要受體的表達從而抑制免疫細胞的功能尚未見相關(guān)報道。鑒于MR在抗隱球菌感染免疫的重要作用，我們觀察了隱球菌對MR的表達調(diào)節(jié)及其調(diào)節(jié)機制，并對其病理生理意義進行了研究。 隱球菌困擾人類的另一大問題就是其嗜中樞性，常表現(xiàn)為致命性的腦膜炎/腦膜腦炎。目前認為隱球菌嗜中樞性與以下因素有關(guān)：1、依賴于單核細胞的木馬機制；2、活化Rho GTPases；3、活化尿激酶纖溶酶原系統(tǒng)；4、新生隱球菌CPS1基因透明質(zhì)酸CD44分子；5、自身的尿素酶。我們前期研究發(fā)現(xiàn)隱球菌可以上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細胞S100A10的表達，且抑制S100A10表達降低了腦微血管內(nèi)皮細胞吞噬隱球菌的能力，被吞噬的隱球菌出芽率降低，莢膜增厚，表明沉默S100A10蛋白的表達降低了隱球菌在腦微血管內(nèi)皮細胞內(nèi)的生存能力，提示S100A10可能與隱球菌入侵腦微血管內(nèi)皮細胞有關(guān)。因為尿激酶活化的纖溶酶系統(tǒng)有助于隱球菌通過血腦屏障，而纖溶酶系統(tǒng)的活化需要內(nèi)皮細胞S100A10的參與，因此，我們對隱球菌上調(diào)腦微血管內(nèi)皮細胞S100A10表達的病理生理意義進行了深入的研究，擬明確隱球菌上調(diào)S100A10的表達與其通過血腦屏障的關(guān)系。 一、隱球菌調(diào)節(jié)MR表達及其相關(guān)機制研究 首先我們觀察了隱球菌對免疫細胞MR的表達的調(diào)節(jié)，我們發(fā)現(xiàn)隱球菌可以下調(diào)DCs及巨噬細胞MR基因水平及蛋白水平的表達，MR表達的下調(diào)并不是由于膜MR脫落成可溶性SMR所致，而是基因水平的下降。有趣的是，使用Transwell小室將菌體與細胞隔開并沒有觀察到這種變化，說明隱球菌下調(diào)MR的表達依賴于菌體與細胞的直接接觸，但與菌的活力無關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MR的配體MP可以下調(diào)MR的表達，這一現(xiàn)象類似于LPS下調(diào)TLR4的表達，而后者被認為是導(dǎo)致內(nèi)毒素耐受的機制之一，這可能是隱球菌逃逸機體免疫的一種手段。 二、MR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究 因MR胞內(nèi)段缺乏ITAM模序，因此我們推測MP作用于MR啟動的信號通路的活化需要其他受體的參與。首先我們觀察了MP刺激后巨噬細胞MAPK、NF κB的活化情況，我們發(fā)現(xiàn)，MP可以促進巨噬細胞p38、ERK、JNK、p65的磷酸化，敲除TLR2后上述信號通路的磷酸化均明顯受到影響，說明TLR2參與了MR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，敲除TLR2明顯降低了MR促進的巨噬細胞IL6、TNF α、IL1β等促炎細胞因子的分泌，并且降低了巨噬細胞殺傷隱球菌的能力，說明TLR2在巨噬細胞抗隱球菌感染免疫中具有重要的作用。應(yīng)用p38抑制劑我們發(fā)現(xiàn)，隱球菌和MP下調(diào)MR的作用被抑制，因此，隱球菌下調(diào)MR的表達是通過活化p38MAPK實現(xiàn)的。 三、隱球菌下調(diào)MR表達的病理生理意義研究 由于觀察到隱球菌可以下調(diào)MR的表達，因此我們探索了該現(xiàn)象的病理生理意義。我們發(fā)現(xiàn)過表達MR的DCs抗原遞呈MP的能力明顯增強，活化T細胞的能力也增強，說明DCs的抗隱球菌免疫能力與MR的表達水平呈正相關(guān)。接下來我們觀察了降低MR表達對巨噬細胞功能的影響，我們發(fā)現(xiàn)，抑制MR的表達降低了巨噬細胞吞噬和殺傷隱球菌的能力，說明巨噬細胞抗隱球菌感染免疫的能力也與MR的表達水平呈正相關(guān)。因此，我們認為，隱球菌下調(diào)MR的表達抑制了機體的免疫應(yīng)答，從而逃避機體的抗隱球菌免疫反應(yīng)，這可能是隱球菌免疫逃逸的一個新的機制。 四、S100A10與隱球菌嗜中樞性的機制研究 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，隱球菌可以上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細胞S100A10的表達，抑制S100A10的表達明顯降低了內(nèi)皮細胞吞噬隱球菌的能力,并且被吞噬的隱球菌出芽率降低、莢膜變厚，說明S100A10可能在隱球菌侵襲血管內(nèi)皮細胞的過程中具有重要作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，隱球菌可以上調(diào)小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞S100A10的表達，通過干擾慢病毒載體沉默S100A10的表達降低了依賴于纖溶酶的隱球菌通過血腦屏障的能力，但對未包被纖溶酶原的隱球菌通過血腦屏障的能力影響不大，說明S100A10影響隱球菌通過血腦屏障依賴于纖溶酶原的存在。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，沉默S100A10的表達降低了尿激酶及纖溶酶原的活化，而升高的尿激酶纖溶酶的活性被認為與隱球菌侵襲血腦屏障有關(guān)，因此，隱球菌促進S100A10尿激酶纖溶酶系統(tǒng)的活化可能與其嗜中樞性有關(guān)。 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)了隱球菌可以下調(diào)MR的表達，MR表達的降低可能是隱球菌誘導(dǎo)免疫細胞的功能抑制的一個新的途徑，而隱球菌上調(diào)S100A10的表達與其嗜中樞性有關(guān)，下一步研究可通過構(gòu)建MR轉(zhuǎn)基因小鼠和S100A10基因敲除小鼠進一步從體內(nèi)予以證實。
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【圖文】：

圖 1.腺病毒穿梭質(zhì)粒 pShuttle CMV 圖譜Fig.1.Physical map of pShuttle CMV vectorMR 穩(wěn)定干擾載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染，由上海吉瑪設(shè)計合成 3 對 MR 的 siRNA 序列：si1：5 ggcttacggtgaaccaaat gtgggttatttacaaaga 3，si3：5 ccgtgttgaacctcttaaa 3，3 對 siRNA 轉(zhuǎn)分別染小鼠原細胞（6 孔板轉(zhuǎn)染體系：siRNA 終濃度 100nM, INTERFERin 12ul），轉(zhuǎn)染 72解蛋白做 Western blot 分析 MR 的表達情況，si2 和 si3 干擾效率尚可。選 MR 穩(wěn)定干擾載體，克隆至 pGPU6/Hygro（上海吉瑪，圖 3）載體中，經(jīng)測正確后，用于 Ana 1 細胞的轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定篩選。轉(zhuǎn)染步驟為：待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒 DRFERin（Polyplus）按一定比例混合于 200ul Opti MEM，室溫作用 10 分鐘，0%匯合生長于 6 孔細胞培養(yǎng)板的 Ana 1 細胞系，置 37°C 5% CO2 培養(yǎng) 6 8 小鮮培養(yǎng)基。

學位論文定干擾細胞系 Ana 1/的篩選之前，先確定潮霉素的最佳篩選濃度，具體如下：將 An在 100ug/mL~1mg/ml 的濃度范圍內(nèi)進行篩選，選擇出在最低潮霉素濃度來進行下一步的篩選試驗。最終確轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)染 24 48 小時之后開始加潮霉素篩選，每 3~5液，有限稀釋法把陽性克隆在 96 孔板中篩選，經(jīng) Wester Ana 1/。同時以空白對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Ana 1 細胞，設(shè)立對

：20 mM Tris HCl, 0.5 M NaCl, 1 mM MnCl2, 1 mM CaCl基 α D 吡喃甘露糖苷的 20 mM Tris HCl, 0.5 M NaCl, pH 0 層析系統(tǒng)（Amershan Biosciences），操作流程：首先用onA4B 柱，樣品以 0.5ml/min 過柱，再用 10ml 結(jié)合緩沖液中不含碳水化合物及蛋白，最后使用 5ml 洗脫液洗脫脫液到達結(jié)合柱后暫停 5min，可提高洗脫效率。將洗脫的交換成 PBS 并濃縮，測濃度后過濾，存于 20℃?zhèn)溆�。露糖蛋白銀染鑒定上清超濾濃縮液（Crude，CR）、流穿液（Flow throw，F(xiàn)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣量 30μg/孔。電泳后使用天公司的快速銀染試劑盒，操作流程：首先使用凝膠固水各洗滌 1 次，加入 100mL 銀染增敏液增敏 2min，水洗溶液在搖床上室溫搖動 10min，水洗 1.5min 后加入顯色想的預(yù)期蛋白條帶加終止液終止顯色，水洗 10min，拍照

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉明;姜格寧;;肺隱球菌病的外科治療[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2006年05期

本文編號：2786680