【摘要】：隱球菌系環(huán)境腐生菌，常引起免疫功能低下人群的感染，隱球菌性腦膜炎/腦膜腦炎是其高病死率的最主要的原因。隱球菌感染一般有兩個(gè)結(jié)局，一是宿主免疫反應(yīng)清除隱球菌，另一個(gè)就是隱球菌成功逃逸機(jī)體的免疫應(yīng)答，從而造成潛伏感染或播撒。目前認(rèn)為隱球菌逃逸機(jī)體的免疫殺傷有以下幾個(gè)途徑：1、“吞噬體擠出”與細(xì)胞內(nèi)復(fù)制；2、溶解巨噬細(xì)胞或誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡；3、避免被巨噬細(xì)胞吞噬；4、遮蓋病原體相關(guān)分子模式（PAMP），避免宿主免疫識(shí)別；5、誘導(dǎo)機(jī)體免疫抑制。 甘露糖受體（Mannose receptor，MR）也叫CD206，主要由巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)，屬于C型凝集素樣受體，是一種模式識(shí)別受體，不僅可以識(shí)別并結(jié)合病原生物的多種糖蛋白，介導(dǎo)固有免疫應(yīng)答，而且通過(guò)其抗原提呈等功能，可以促進(jìn)T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子釋放，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。新生隱球菌甘露糖蛋白（Mannoprotein，MP）是MR的配體，MP可有效激活機(jī)體T細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)小鼠的抗隱球菌感染免疫，表現(xiàn)在MP免疫小鼠可以延長(zhǎng)其新生隱球菌感染后的生存時(shí)間和降低器官的真菌荷載，且DCs可以通過(guò)MR和FC受體吞噬隱球菌，進(jìn)而遞呈抗原給T細(xì)胞，誘發(fā)機(jī)體的抗隱球菌免疫應(yīng)答。目前有關(guān)隱球菌逃逸機(jī)體免疫應(yīng)答的研究主要集中在隱球菌莢膜相關(guān)基因及隱球菌巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，而對(duì)于隱球菌是否通過(guò)影響某些重要受體的表達(dá)從而抑制免疫細(xì)胞的功能尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。鑒于MR在抗隱球菌感染免疫的重要作用，我們觀察了隱球菌對(duì)MR的表達(dá)調(diào)節(jié)及其調(diào)節(jié)機(jī)制，并對(duì)其病理生理意義進(jìn)行了研究。 隱球菌困擾人類的另一大問(wèn)題就是其嗜中樞性，常表現(xiàn)為致命性的腦膜炎/腦膜腦炎。目前認(rèn)為隱球菌嗜中樞性與以下因素有關(guān)：1、依賴于單核細(xì)胞的木馬機(jī)制；2、活化Rho GTPases；3、活化尿激酶纖溶酶原系統(tǒng)；4、新生隱球菌CPS1基因透明質(zhì)酸CD44分子；5、自身的尿素酶。我們前期研究發(fā)現(xiàn)隱球菌可以上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞S100A10的表達(dá)，且抑制S100A10表達(dá)降低了腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞吞噬隱球菌的能力，被吞噬的隱球菌出芽率降低，莢膜增厚，表明沉默S100A10蛋白的表達(dá)降低了隱球菌在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的生存能力，提示S100A10可能與隱球菌入侵腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)。因?yàn)槟蚣っ富罨睦w溶酶系統(tǒng)有助于隱球菌通過(guò)血腦屏障，而纖溶酶系統(tǒng)的活化需要內(nèi)皮細(xì)胞S100A10的參與，因此，我們對(duì)隱球菌上調(diào)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞S100A10表達(dá)的病理生理意義進(jìn)行了深入的研究，擬明確隱球菌上調(diào)S100A10的表達(dá)與其通過(guò)血腦屏障的關(guān)系。 一、隱球菌調(diào)節(jié)MR表達(dá)及其相關(guān)機(jī)制研究 首先我們觀察了隱球菌對(duì)免疫細(xì)胞MR的表達(dá)的調(diào)節(jié)，我們發(fā)現(xiàn)隱球菌可以下調(diào)DCs及巨噬細(xì)胞MR基因水平及蛋白水平的表達(dá)，MR表達(dá)的下調(diào)并不是由于膜MR脫落成可溶性SMR所致，而是基因水平的下降。有趣的是，使用Transwell小室將菌體與細(xì)胞隔開(kāi)并沒(méi)有觀察到這種變化，說(shuō)明隱球菌下調(diào)MR的表達(dá)依賴于菌體與細(xì)胞的直接接觸，但與菌的活力無(wú)關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MR的配體MP可以下調(diào)MR的表達(dá)，這一現(xiàn)象類似于LPS下調(diào)TLR4的表達(dá)，而后者被認(rèn)為是導(dǎo)致內(nèi)毒素耐受的機(jī)制之一，這可能是隱球菌逃逸機(jī)體免疫的一種手段。 二、MR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究 因MR胞內(nèi)段缺乏ITAM模序，因此我們推測(cè)MP作用于MR啟動(dòng)的信號(hào)通路的活化需要其他受體的參與。首先我們觀察了MP刺激后巨噬細(xì)胞MAPK、NF κB的活化情況，我們發(fā)現(xiàn)，MP可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞p38、ERK、JNK、p65的磷酸化，敲除TLR2后上述信號(hào)通路的磷酸化均明顯受到影響，說(shuō)明TLR2參與了MR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲除TLR2明顯降低了MR促進(jìn)的巨噬細(xì)胞IL6、TNF α、IL1β等促炎細(xì)胞因子的分泌，并且降低了巨噬細(xì)胞殺傷隱球菌的能力，說(shuō)明TLR2在巨噬細(xì)胞抗隱球菌感染免疫中具有重要的作用。應(yīng)用p38抑制劑我們發(fā)現(xiàn)，隱球菌和MP下調(diào)MR的作用被抑制，因此，隱球菌下調(diào)MR的表達(dá)是通過(guò)活化p38MAPK實(shí)現(xiàn)的。 三、隱球菌下調(diào)MR表達(dá)的病理生理意義研究 由于觀察到隱球菌可以下調(diào)MR的表達(dá)，因此我們探索了該現(xiàn)象的病理生理意義。我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)MR的DCs抗原遞呈MP的能力明顯增強(qiáng)，活化T細(xì)胞的能力也增強(qiáng)，說(shuō)明DCs的抗隱球菌免疫能力與MR的表達(dá)水平呈正相關(guān)。接下來(lái)我們觀察了降低MR表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響，我們發(fā)現(xiàn)，抑制MR的表達(dá)降低了巨噬細(xì)胞吞噬和殺傷隱球菌的能力，說(shuō)明巨噬細(xì)胞抗隱球菌感染免疫的能力也與MR的表達(dá)水平呈正相關(guān)。因此，我們認(rèn)為，隱球菌下調(diào)MR的表達(dá)抑制了機(jī)體的免疫應(yīng)答，從而逃避機(jī)體的抗隱球菌免疫反應(yīng)，這可能是隱球菌免疫逃逸的一個(gè)新的機(jī)制。 四、S100A10與隱球菌嗜中樞性的機(jī)制研究 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，隱球菌可以上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞S100A10的表達(dá)，抑制S100A10的表達(dá)明顯降低了內(nèi)皮細(xì)胞吞噬隱球菌的能力,并且被吞噬的隱球菌出芽率降低、莢膜變厚，說(shuō)明S100A10可能在隱球菌侵襲血管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)程中具有重要作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，隱球菌可以上調(diào)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞S100A10的表達(dá)，通過(guò)干擾慢病毒載體沉默S100A10的表達(dá)降低了依賴于纖溶酶的隱球菌通過(guò)血腦屏障的能力，但對(duì)未包被纖溶酶原的隱球菌通過(guò)血腦屏障的能力影響不大，說(shuō)明S100A10影響隱球菌通過(guò)血腦屏障依賴于纖溶酶原的存在。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，沉默S100A10的表達(dá)降低了尿激酶及纖溶酶原的活化，而升高的尿激酶纖溶酶的活性被認(rèn)為與隱球菌侵襲血腦屏障有關(guān)，因此，隱球菌促進(jìn)S100A10尿激酶纖溶酶系統(tǒng)的活化可能與其嗜中樞性有關(guān)。 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)了隱球菌可以下調(diào)MR的表達(dá)，MR表達(dá)的降低可能是隱球菌誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的功能抑制的一個(gè)新的途徑，而隱球菌上調(diào)S100A10的表達(dá)與其嗜中樞性有關(guān)，下一步研究可通過(guò)構(gòu)建MR轉(zhuǎn)基因小鼠和S100A10基因敲除小鼠進(jìn)一步從體內(nèi)予以證實(shí)。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363
【圖文】：

圖 1.腺病毒穿梭質(zhì)粒 pShuttle CMV 圖譜Fig.1.Physical map of pShuttle CMV vectorMR 穩(wěn)定干擾載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染，由上海吉瑪設(shè)計(jì)合成 3 對(duì) MR 的 siRNA 序列：si1：5 ggcttacggtgaaccaaat gtgggttatttacaaaga 3，si3：5 ccgtgttgaacctcttaaa 3，3 對(duì) siRNA 轉(zhuǎn)分別染小鼠原細(xì)胞（6 孔板轉(zhuǎn)染體系：siRNA 終濃度 100nM, INTERFERin 12ul），轉(zhuǎn)染 72解蛋白做 Western blot 分析 MR 的表達(dá)情況，si2 和 si3 干擾效率尚可。選 MR 穩(wěn)定干擾載體，克隆至 pGPU6/Hygro（上海吉瑪，圖 3）載體中，經(jīng)測(cè)正確后，用于 Ana 1 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定篩選。轉(zhuǎn)染步驟為：待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒 DRFERin（Polyplus）按一定比例混合于 200ul Opti MEM，室溫作用 10 分鐘，0%匯合生長(zhǎng)于 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的 Ana 1 細(xì)胞系，置 37°C 5% CO2 培養(yǎng) 6 8 小鮮培養(yǎng)基。

學(xué)位論文定干擾細(xì)胞系 Ana 1/的篩選之前，先確定潮霉素的最佳篩選濃度，具體如下：將 An在 100ug/mL~1mg/ml 的濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在最低潮霉素濃度來(lái)進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。最終確轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染 24 48 小時(shí)之后開(kāi)始加潮霉素篩選，每 3~5液，有限稀釋法把陽(yáng)性克隆在 96 孔板中篩選，經(jīng) Wester Ana 1/。同時(shí)以空白對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Ana 1 細(xì)胞，設(shè)立對(duì)

：20 mM Tris HCl, 0.5 M NaCl, 1 mM MnCl2, 1 mM CaCl基 α D 吡喃甘露糖苷的 20 mM Tris HCl, 0.5 M NaCl, pH 0 層析系統(tǒng)（Amershan Biosciences），操作流程：首先用onA4B 柱，樣品以 0.5ml/min 過(guò)柱，再用 10ml 結(jié)合緩沖液中不含碳水化合物及蛋白，最后使用 5ml 洗脫液洗脫脫液到達(dá)結(jié)合柱后暫停 5min，可提高洗脫效率。將洗脫的交換成 PBS 并濃縮，測(cè)濃度后過(guò)濾，存于 20℃?zhèn)溆谩Ｂ短堑鞍足y染鑒定上清超濾濃縮液（Crude，CR）、流穿液（Flow throw，F(xiàn)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣量 30μg/孔。電泳后使用天公司的快速銀染試劑盒，操作流程：首先使用凝膠固水各洗滌 1 次，加入 100mL 銀染增敏液增敏 2min，水洗溶液在搖床上室溫?fù)u動(dòng) 10min，水洗 1.5min 后加入顯色想的預(yù)期蛋白條帶加終止液終止顯色，水洗 10min，拍照

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉明;姜格寧;;肺隱球菌病的外科治療[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2006年05期

本文編號(hào)：2786680