發(fā)布時(shí)間：2020-08-09 04:42

【摘要】：登革病毒感染是一種蚊傳播疾病，主要流行于熱帶、亞熱帶地區(qū)。在臨床上，登革病毒感染可引起登革熱、登革出血熱或登革休克綜合癥。近年來，登革熱、登革出血熱或登革休克綜合癥的發(fā)病率不斷升高，全球每年有大約0.8～1億登革熱和25～50萬登革出血熱或登革休克綜合癥患者。對(duì)登革病毒感染目前尚無有效的預(yù)防及治療措施，對(duì)患者進(jìn)行早期診斷是監(jiān)控登革熱流行和控制疾病發(fā)展的有效措施。 近年來國(guó)際上興起的一種新型基因檢測(cè)技術(shù)——基因芯片技術(shù)，為登革病毒感染的早期診斷提供了一種快速、高效、敏感、經(jīng)濟(jì)、自動(dòng)化的方法，并可同時(shí)進(jìn)行登革病毒基因的檢測(cè)和分型。 在分類上，基因芯片基本上可分為cDNA芯片和寡核苷酸芯片兩種。本論文針對(duì)登革病毒感染研制可用于登革病毒基因早期診斷的cDNA芯片和寡核苷酸芯片。 cDNA檢測(cè)芯片采用cDNA文庫(kù)法收集探針：以2型登革病毒16681株的cDNA質(zhì)粒為材料，利用長(zhǎng)片斷PCR技術(shù)擴(kuò)增2型登革病毒的全長(zhǎng)cDNA，Sau3A Ⅰ酶切長(zhǎng)片段擴(kuò)增產(chǎn)物，利用耐熱性DNA聚合酶對(duì)酶切后形成的粘性末端進(jìn)行補(bǔ)平加A；純化補(bǔ)平加A產(chǎn)物，將其克隆到T載體上。對(duì)克隆進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果獲得142個(gè)陽性克隆。采用巢式PCR擴(kuò)增制備探針，用PixSys 5500型基因芯片打印儀將探針點(diǎn)樣到氨基硅烷包被的玻片上，制備登革病毒cDNA檢測(cè)芯片。通過對(duì)逆轉(zhuǎn)錄及馬文麗、鄭文嶺等建立的RD技術(shù)兩種標(biāo)記方法的比較分析，結(jié)果顯示采用RD技術(shù)標(biāo)記的樣品，獲得的雜交信號(hào)強(qiáng)，靈敏度高，故在后續(xù)的雜交分析中均采用此標(biāo)記方法。在42℃、52℃、62℃三種不同的雜交溫度條件下，分別將登革病毒cDNA芯片與人DNA及大腸桿菌DNA雜交，摸索到能減少非特異性雜交、提高芯片檢測(cè)特異性的62℃高溫雜交體系。在此雜交體系下，cDNA芯片與登革病毒樣品雜交均有較強(qiáng)的陽性雜交信號(hào)，根據(jù)較特異的雜交圖譜，可實(shí)現(xiàn)對(duì)登革病毒基因的有效檢測(cè)。同時(shí)用登革病毒cDNA芯片與人基因組DNA、大腸桿菌DNA、丙肝病毒cDNA和乙腦病毒cDNA進(jìn)行非特異性雜交分析，篩選到8個(gè)特異的登革病毒探針，擬作為針對(duì)多種病原體檢測(cè)的集成芯片探針。進(jìn)一步將9份登革病 毒廣東地方分離株樣品與登革病毒cDNA芯片雜交:進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)?zāi)樢?證，結(jié)果均能得到雜交信號(hào)較強(qiáng)的陽性結(jié)果， 革病毒基因檢測(cè)的可靠性。 初步證實(shí)了該芯片用于登 寡核昔酸芯片的制備方法有原位合成法和合成點(diǎn)樣法兩種，原位合 成法有嚴(yán)格的專利限制，故采用合成點(diǎn)樣法制備登革病毒寡核營(yíng)酸芯片。 首先利用在線的BLAST檢索程序分別對(duì)4種型別登革病毒序列進(jìn)行同源 性分析，找出各型登革病毒的特異性序列區(qū)段，然后遵照探針設(shè)計(jì)的一 般原則，采用生物學(xué)軟件011906.0在特異性區(qū)段篩選長(zhǎng)度為60bP的寡核普 酸探針，使各探針的GC含量、Tm值、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等重要參數(shù)盡量趨于一 致�？紤]到樣品標(biāo)記時(shí)，需行Sau劃I酶切消化，因而我們?cè)谠O(shè)計(jì)探針 的過程中也進(jìn)行了Sau 3AI酶切位點(diǎn)分析。最終我們?cè)O(shè)計(jì)了22條60一mer的 登革病毒寡核營(yíng)酸探針。人工合成寡核普酸探針，用Pixsys 5500型基因 芯片打印儀將探針打印、固定在多聚一L一賴氨酸包被的DAKO玻片上。應(yīng) 用RD一技術(shù)標(biāo)記各型登革病毒樣品及人基因組DNA，然后分別與寡核普 酸芯片進(jìn)行雜交，雜交結(jié)果顯示:人基因組DNA與芯片無非特異性雜交， 而各型登革病毒樣品與芯片均有特異性雜交，且各型登革病毒樣品只與 自身相應(yīng)的型特異性探針雜交，不與其它型別的檢測(cè)探針雜交，說明寡 核普酸芯片的特異性高，可用于登革病毒基因的檢測(cè)和分型。
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R346
【圖文】：

二、結(jié)果1.長(zhǎng)片斷PCR擴(kuò)增2型登革病毒全長(zhǎng)cDNA圖1一4為長(zhǎng)片斷PCR擴(kuò)增2型登革病毒全長(zhǎng)cDNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果�？梢钥闯鰯U(kuò)增產(chǎn)物為特異的單一條帶，其片斷大小與預(yù)期相符，約10.7kb。M1以以漢0(5八U，獷5J.J工.25(1OC圖1一4長(zhǎng)片斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖Fig.l一4:0.6%agarosegelelectroPhoresisoflongPCRProductsofdenguevirus2.LaneM:DL2000marker;Lanel:longPCRProduets.2.2型登革病毒cDNA文庫(kù)的構(gòu)建長(zhǎng)片斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Sau3AI酶切、AT克隆得到的白色菌落經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用pMD18一T載體引物50100、50101進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用2.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定，結(jié)果可見分子質(zhì)量不同的DNA條帶(見圖1一5)。通過PCR初步鑒定方法，共篩選到142個(gè)克隆片段大小為100~1000bp的陽性克隆。

用ABIPRIsMTM310自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)部分陽性克隆片段進(jìn)行序列分析，將所得序列分析結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast序列比對(duì)，結(jié)果證明陽性克隆均來自于2型登革病毒。圖1一6為其中一個(gè)克隆片斷的測(cè)序結(jié)Fig.l一6SequencingofoneofeDNAfragmentsfromDenguevirus2elones·

M12345678910111213八U八Un甘n甘﨑h汽U50710內(nèi)乙1圖1一5克隆的PCR鑒定電泳圖Fig.1一5:PCRidentifieationofdenguevirusserotyPe2eDNAfragmentselones.3.克隆片段的序列測(cè)定與Genebaxlk同源性比較用ABIPRIsMTM310自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)部分陽性克隆片段進(jìn)行序列分析，將所得序列分析結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast序列比對(duì)，結(jié)果證明陽性克隆均來自于2型登革病毒。圖1一6為其中一個(gè)克隆片斷的測(cè)序結(jié)

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 馬孟根;豬源致病性沙門氏菌耐藥基因PCR和基因芯片檢測(cè)技術(shù)研究[D];四川大學(xué);2005年

本文編號(hào)：2786623