【摘要】： SELEX技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment)即指數(shù)擴(kuò)增配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，是90年代初建立的一種體外文庫篩選方法。SELEX技術(shù)的基本思想是合成一個兩端為固定序列，中間為隨機(jī)序列的單鏈寡核苷酸庫(RNA或DNA)，庫中序列的多樣性可反映為二級結(jié)構(gòu)的多樣性；將它與靶物質(zhì)混合，形成靶物質(zhì)—寡核苷酸的復(fù)合物，去除未與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸，分離與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，并以此類核酸分子為模板由固定序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物再進(jìn)行下一輪的篩選過程；通過多輪的篩選與擴(kuò)增，一些與靶物質(zhì)不結(jié)合或與靶物質(zhì)只有低親和力的寡核苷酸被去除，而與靶物質(zhì)有較高親和力的“適配子”(Aptamer)將逐漸得到富集。這一方法的原理簡單，操作簡便易行，一經(jīng)問世，便得到了廣泛的應(yīng)用。適配子具有親和力高且特異性好等特點(diǎn)，而且易于標(biāo)準(zhǔn)化，目前正在成為一種新的診斷試劑。目前，已有研究者將凝血酶的適配子成功地固化在光纖傳感器上，用以檢測凝血酶，這一工作為生物戰(zhàn)劑傳感器的研制提示了新的方向。國外有利用SELEX技術(shù)篩選炭疽桿菌芽孢適配子的報道，但其使用的是高壓滅菌處理后的芽孢，而且沒有完成適配子特異性、親和力以及結(jié)構(gòu)與功能的考察，在這一方面還有許多工作急待進(jìn)行。國內(nèi)有關(guān)SELEX技術(shù)的研究起步較晚，文獻(xiàn)報道較少。 本研究工作將系統(tǒng)地進(jìn)行炭疽桿菌芽孢適配子的研究，并基于適配子的特性，建立一種以尼龍膜為載體，炭疽芽孢適配子為檢測分子來檢測炭疽芽孢的方法；此外，由于許多生物戰(zhàn)劑的單克隆抗體研制存在困難，本研究可為解決這一難題提供新的思路。我們一直期望能將SELEX這一新技術(shù)應(yīng)用到微生物檢測的研究工作中。適配子是一段寡核苷酸，其穩(wěn)定性優(yōu)于單克隆抗體，已有實驗證明SELEX技術(shù)可以篩選到特異性和親和力都強(qiáng)于單克隆抗體的適配子；而適配子與靶物質(zhì)的結(jié)合是結(jié)構(gòu)依賴性，而不是序列依賴性的，因此不需雜交等步驟；此外適 配于的篩選是一種體外篩選，不涉及免疫過程，適用范困廣。 基于上述考慮，結(jié)合國外的技術(shù)進(jìn)展和自身工作的實際需要，我們 擬定了這一課題，目的不僅在于以炭疽桿菌的芽抱作為篩選模式，篩選 到炭疽芽抱特異的適配子，將篩選到的適配子作結(jié)構(gòu)與功能研究，并將 親和性較好的適配子作為檢測炭疽芽抱的檢測分子；還期望在我們實驗 室建立起行之有效的SELEX技術(shù)，用于單克隆抗體制備存在困難的其它 生物戰(zhàn)劑，為生物戰(zhàn)劑的快速偵檢開辟新的思路。 研究結(jié)果顯示：在體外構(gòu)建的兩端為固定序列，中I’riJ隨機(jī)區(qū)域為 35個核昔酸序列，其全長為78個核昔酸的隨機(jī)寡核昔酸文庫的基礎(chǔ)卜， 用炭疽稈菌疫茵株 A．161｛的芽抱為靶物質(zhì)，在含有 2價 Mg‘”存在的情況 下，按SSDNA：炭疽芽抱＝l…g：1．5X108混合，經(jīng)過了十／輪“吸附－ 漂洗－洗脫－擴(kuò)增”的SELEX過程，同時，每三輪的篩選產(chǎn)物用蠟樣芽 抱桿菌芽抱進(jìn)行反篩，以提高篩選的特異性。篩選產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)增后在 15％ 的聚丙烯酚胺凝膠電泳圖中顯示，隨著篩選輪數(shù)的增加，PCR擴(kuò)增電 泳條帶逐漸單純。為了提高產(chǎn)物的忠實性，PCR擴(kuò)增的優(yōu)化條件為： 采用熱啟動法擴(kuò)增可以穩(wěn)定地獲得較好的擴(kuò)增結(jié)果；退火溫度在58OC ～68C、循環(huán)數(shù)為20～22時，有預(yù)期的擴(kuò)增帶。將每輪的篩選產(chǎn)物用標(biāo) 有生物素的引物PCR擴(kuò)增后，與炭疽芽抱進(jìn)行結(jié)合實驗，TMB顯色系 統(tǒng)提示，第十八輪篩選的炭疽芽抱適配子庫與芽抱結(jié)合后顯色O＊值 比第一輪的O＊值提高了37 fg以上，在第六輪篩選時，出現(xiàn)了O＊值 降低，這種現(xiàn)象的產(chǎn)生是山于篩選壓”（選擇／進(jìn)化壓）的影響，使得篩 選庫中所期望得到的寡核昔酸片段的特異性增強(qiáng)。在考察篩選庫的特異 性時，將高壓滅菌后的炭疽芽抱和篩選用炭疽芽泡約 IXIO’分別與第十 八輪的篩選庫巾g作結(jié)合實驗，檢測的0．D值分別是0．193和 1．1H， 說明了篩選產(chǎn)物對靶物質(zhì)的特異性較強(qiáng)�？紤]到芽抱是一個多表位的靶 物質(zhì)，是個混合靶物質(zhì)的篩選過程，篩選的適配子是多樣的，我們將篩 選庫進(jìn)行了單鏈和雙鏈（加熱與不加熱）DNA與炭疽芽抱的結(jié)合實驗。 結(jié)果顯示，適配子與芽抱結(jié)合以單鏈為主，雙鏈也有結(jié)合。 在經(jīng)過了成功的十八輪SELEX篩選后，將篩選產(chǎn)物－寡核昔酸片段 進(jìn)行了克隆，在500個克隆子中隨機(jī)選取79個克隆子進(jìn)行了測序，將 測序結(jié)果按堿基多少分為A、BVH群，AJty的54條與預(yù)期片段大小一致， 一10 一 少數(shù)片段在3’端固定區(qū)有個別堿基突變山群為25條大小不等的片段。 可分為兩個亞群，BI群為12條隨機(jī)序列區(qū)域短于所期望長度的片段， 并在隨機(jī)區(qū)域或 3’端引物區(qū)域有堿基突變；BZ群為＊ 條長于預(yù)期長 度的片段，主要表現(xiàn)在3’端引物序列的重復(fù)出現(xiàn)。造成短于彬］望片段 長短的原因可能是山于跳躍PCR的影響；長于期望片段長度的原因PJ‘能 是低溫下，引物與隨機(jī)區(qū)域退火延伸所致。將測序序列（適配－f）計算 機(jī)分析軟件分析測序序列的保守
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：R346

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2 胡燕;劉U

本文編號：2786569