【摘要】：目的：A群鏈球菌（Group A streptococcus，GAS）是常見的人類致病菌，能夠引起各種化膿性感染性疾病，包括咽炎、扁桃體炎等輕型感染，以及感染后的自身免疫病、致死率很高的毒素性疾病，如風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性心臟病、免疫性腦病、牛皮癬、腎小球腎炎以及毒性休克綜合征、猩紅熱等，嚴(yán)重威脅人體健康。機(jī)體試圖利用免疫防御功能清除細(xì)菌，阻斷感染，但由于鏈球菌有強(qiáng)大的免疫逃逸能力，所以鏈球菌感染表現(xiàn)為遷延及反復(fù)感染狀態(tài)。目前，研究表明GAS的免疫逃逸表現(xiàn)在多方面，一方面是細(xì)菌依靠本身的毒力因子，包括M蛋白、Fba、SpeB等因素進(jìn)行免疫逃逸；另一方面是GAS通過與宿主的相互作用，消弱或抑制宿主免疫防御功能而進(jìn)行免疫逃逸。固有免疫是機(jī)體的第一道防線，是特異性免疫的基礎(chǔ)，巨噬細(xì)胞是一類重要的執(zhí)行固有免疫的細(xì)胞，它以模式識別受體識別、結(jié)合細(xì)菌的病原相關(guān)分子模式，通過信號傳導(dǎo)通路致細(xì)胞活化，以多種機(jī)制殺死和清除細(xì)菌。而GAS在免疫逃逸過程中進(jìn)化出各種策略，挑戰(zhàn)固有免疫細(xì)胞的清除作用，上調(diào)宿主細(xì)胞免疫負(fù)調(diào)節(jié)因子就是其免疫逃逸的重要手段之一。NF-κB通路是巨噬細(xì)胞激活的重要通路，調(diào)節(jié)此通路的的免疫抑制分子有多種，如MyD88s、SHIP1、RP105、IRAK-M Tollip、A20、TRAILR、 SOCS-1、NOD2、C5a、Stlr、SIGIRR和RIP3等，這些分子的調(diào)控機(jī)制各不相同，但最終都能對NF-κB信號通路起負(fù)調(diào)節(jié)作用。本室前期工作已證實，GAS可以誘導(dǎo)鼠巨噬細(xì)胞（MΦ）產(chǎn)生高水平的免疫負(fù)調(diào)節(jié)因子A20，本研究在此基礎(chǔ)上聚焦于上調(diào)A20表達(dá)的GAS菌體成分以及作用機(jī)制的研究。 A20為鋅指蛋白，又稱為腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(tumor necrosisfactor alpha induced protein3,TNFAIP3)，也稱作腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白A20(tumor necrosis factor, alpha induced protein a20,TNFAIPA20)。作為負(fù)調(diào)控因子，A20能在多種組織細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)刺激因素包括細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子、IL-1、CD40等，其他還有佛波醇酯、過氧化氫、細(xì)菌和病毒以及它們的代謝產(chǎn)物脂多糖、EB病毒潛伏膜蛋白1等。A20的調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)為對TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、細(xì)胞間黏附分子等多種促炎因子的過度釋放以及對細(xì)胞凋亡和壞死明顯的抑制作用。 A20在發(fā)揮調(diào)控功能時主要利用其雙重泛素化酶功能，使胞漿中相關(guān)信號通路的多種關(guān)鍵蛋白分子泛素化，進(jìn)而被蛋白酶體識別，加速降解，達(dá)到抑制信號通路的作用，抑制促炎因子的表達(dá)，增加抗炎因子的表達(dá)。在NF-κB信號通路中，A20靶向關(guān)鍵的上游成分，如RIP1和TRAF6，使它們泛素化降解，最終引起炎癥通路的抑制。本室前期工作雖已證實GAS與MΦ作用后上調(diào)表達(dá)A20，但A20的表達(dá)變化特征如何？何為誘導(dǎo)A20表達(dá)的GAS相關(guān)成分？為解釋這些問題，本課題進(jìn)行了以下一些探索，首先觀察GAS作用于RAW264.7細(xì)胞致A20表達(dá)的特征，再通過構(gòu)建M蛋白和SpeB基因缺失菌分析上調(diào)A20表達(dá)致免疫逃逸的菌體成分，并通過相應(yīng)的通路分析初步探索A20調(diào)控的機(jī)制。 方法： 1.檢測GAS作用于RAW264.7細(xì)胞致A20蛋白表達(dá)特征：用3個不同濃度的GAS菌（MOI=10:1、50:1、100:1）感染RAW264.7細(xì)胞，設(shè)感染后0.5h、2h、4h、6h、8h、12h刺激孔，行Western blot檢測不同濃度GAS菌作用于RAW264.7細(xì)胞A20蛋白表達(dá)動態(tài)變化特征。 2. GAS致RAW264.7細(xì)胞A20表達(dá)機(jī)制研究： 2.1Real-time PCR和免疫組化法檢測GAS刺激RAW264.7細(xì)胞后，炎癥因子TNF-α mRNA和蛋白的表達(dá)變化。 2.2用放線菌酮阻斷后再行GAS刺激RAW264.7細(xì)胞，免疫組化法檢測TNF-α，Western blot法檢測A20。 2.3用TNFR1抗體阻斷后再行GAS刺激RAW264.7細(xì)胞，Western blot檢測A20蛋白的表達(dá)變化。 2.4Western blot檢測基因敲除鼠MyD88-BMDM細(xì)胞受GAS刺激后A20的表達(dá)變化。 3.構(gòu)建SpeBˉ/-GAS、Mˉ/-GAS基因突變菌：先構(gòu)建重組同源片段自殺質(zhì)粒pFW5/△SpeB和pFW5/△M，再經(jīng)電轉(zhuǎn)化構(gòu)建基因突變菌SpeBˉ/-GAS、Mˉ/-GAS并鑒定。 4. GAS基因突變菌與野生菌作用于RAW264.7細(xì)胞致A20及NF-κB通路相關(guān)分子的表達(dá)差異分析： 4.1wt GAS、SpeBˉ/-GAS、Mˉ/-GAS基因突變菌作用于RAW264.7細(xì)胞后，分別用Real-time PCR和Western blot檢測A20mRNA與蛋白表達(dá)。 4.2Western blot檢測wt GAS、SpeBˉ/-GAS、Mˉ/-GAS基因突變菌作用于RAW264.7細(xì)胞后，NF-κB通路分子TRAF6和P65的表達(dá)差異。 4.3Real-time PCR方法分析SpeBˉ/-GAS、Mˉ/-GAS基因突變菌與wt GAS作用于RAW264.7細(xì)胞后，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)差異。 5. Western blot檢測wt GAS、SpeBˉ/-GAS、Mˉ/-GAS基因突變菌作用于小鼠BMDM細(xì)胞，A20及其調(diào)控的NF-κB通路中TRAF6和P65的表達(dá)差異。 結(jié)果： 1.GAS菌作用于RAW264.7細(xì)胞致A20蛋白表達(dá)的特征：低濃度菌量（MOI=10:1）感染時，RAW264.7細(xì)胞的A20表達(dá)量從感染后2h直至12h維持高水平。中濃度（MOI=50:1）感染，表達(dá)高峰在感染后6h，比低濃度出現(xiàn)晚且維持時間短。高濃度（MOI=100:1）感染，A20的表達(dá)量在2h內(nèi)雖然有所上升，但表達(dá)水平低。 2.A20表達(dá)與TNF-α通路的關(guān)系：Real-time PCR檢測顯示RAW264.7細(xì)胞感染GAS后TNF-α的表達(dá)水平隨時間變化逐漸增強(qiáng)(p0.05)；放線菌酮阻斷RAW264.7細(xì)胞后再感染GAS菌， TNF-α能被有效阻斷；放線菌酮阻斷RAW264.7細(xì)胞后，在GAS菌刺激下A20蛋白表達(dá)明顯減少，說明A20是炎癥因子依賴性表達(dá)。進(jìn)一步以TNFR1抗體阻斷RAW264.7細(xì)胞，接受GAS刺激后A20蛋白表達(dá)明顯低于陽性對照組，但高于正常對照組，提示TNFR1活化通路可以部分誘導(dǎo)A20。 3.MyD88基因敲除鼠的BMDM細(xì)胞在GAS菌刺激下，Western blot檢測A20蛋白無表達(dá)，提示GAS致巨噬細(xì)胞A20表達(dá)為MyD88依賴性。 4.成功構(gòu)建了pFW5/△SpeB與pFW5/△M重組自殺質(zhì)粒，經(jīng)電轉(zhuǎn)化GAS菌構(gòu)建了SpeBˉ/-GAS、Mˉ/-GAS基因突變菌并通過了鑒定。用Mˉ/-GAS基因突變菌作用于RAW264.7細(xì)胞后，分別用Real-time PCR和Western blot檢測A20mRNA與蛋白表達(dá)，與野生菌GAS（wt GAS）作用相比，Mˉ/-GAS使RAW264.7細(xì)胞A20mRNA（p0.01）與蛋白表達(dá)均下降，而SpeBˉ/-GAS使RAW264.7細(xì)胞A20mRNA（p0.01）與蛋白表達(dá)呈上升趨勢。 5.不同菌株(wt GAS、Mˉ/-GAS、SpeBˉ/-GAS）致RAW264.7細(xì)胞A20表達(dá)變化過程中，A20作用通路內(nèi)相應(yīng)信號分子表達(dá)的變化：用wt GAS、Mˉ/-GAS、SpeBˉ/-GAS分別刺激RAW264.7細(xì)胞后在1h、2h、4h、6h、8h幾個時間點動態(tài)觀察底物TRAF6及其下游P65蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)各組內(nèi)TRAF6及P65隨時間進(jìn)展表達(dá)均增加，說明不論成分缺失與否，炎癥反應(yīng)隨著時間變化逐漸增強(qiáng)。與wt GAS刺激組對比，Mˉ/-GAS刺激組的TRAF6及P65表達(dá)處于較高水平，而SpeBˉ/-GAS基因缺失菌TRAF6及P65表達(dá)則減少，與缺失菌刺激A20變化吻合。 6.不同菌株(wt GAS、Mˉ/-GAS、SpeBˉ/-GAS）作用于RAW264.7細(xì)胞后，細(xì)胞因子的表達(dá)變化。用Mˉ/-GAS、SpeBˉ/-GAS作用于RAW264.7細(xì)胞后，Real-time PCR檢測細(xì)胞因子表達(dá)：與wt GAS作用比較，Mˉ/-GAS刺激組IL-1β、IL-6mRNA水平明顯高于wt GAS刺激組（p0.01），有顯著差異；TNF-α mRNA的表達(dá)水平則比wt GAS刺激組低。而SpeBˉ/-GAS刺激組IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)與wt GAS刺激組接近。經(jīng)細(xì)胞因子的表達(dá)變化趨勢分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子變化與相應(yīng)組A20的表達(dá)一致，呈負(fù)相關(guān)。 7.不同菌株(wt GAS、Mˉ/-GAS、SpeBˉ/-GAS）致鼠源BMDM細(xì)胞的A20及TRAF6、 P65蛋白表達(dá)差異。分別行Western blot檢測分析，在2h、4h、6h幾個時間點動態(tài)觀察A20及TRAF6、 P65蛋白表達(dá)差異，與野生菌刺激組相比，各組BMDM細(xì)胞的A20及TRAF6、 P65蛋白表達(dá)特性及趨勢與RAW264.7細(xì)胞相同。 結(jié)論： 1.放線菌酮阻斷實驗證明A20表達(dá)為細(xì)胞因子依賴性。TNFR1抗體阻斷實驗證明A20表達(dá)部分依賴TNFR1途徑。 2.A20誘導(dǎo)表達(dá)為MyD88依賴性。 3.M蛋白能促使A20的表達(dá)，有助于GAS免疫逃逸；而SpeB則沒有此功能。TRAF6及P65檢測、細(xì)胞因子檢測、GAS感染BMDM細(xì)胞實驗均支持以上結(jié)論。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【圖文】：

ase γ (IKKγ), A20 binding inhibitor of NF κB activation 1 (ABI ABIN2，這些分子通過與 A20 結(jié)合實現(xiàn)它們之間的相互作用。A20 enzymes RING-finger protein 11 (RNF11) and ITCH 及與自身結(jié)合的未確定。另外，C103 和 ZF4 模序還有降解 E2 酶的作用[1]，ZF6- Z溶酶體。A20 也要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄后修飾，如靠 IKKβ 的磷酸化，此功在于 OTU 與 ZF1 之間的區(qū)域； 在人體內(nèi)，paracaspase MALT10 的 ZF1 和 ZF2 之間區(qū)域結(jié)合，降解 A20；鼠體內(nèi)降解 A20 的部位定，可能是在 ZF3 和 ZF4 之間的區(qū)域。二、A20 的基因結(jié)構(gòu)與調(diào)節(jié)功能A20 的基因分析見表-1，研究結(jié)果表明，A20 基因 5’上游序列存在度保守的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，如 HSF、Oct-1、AP-1 等。HSP克基因，在應(yīng)激反應(yīng)中與相應(yīng)啟動子結(jié)合，開啟基因的轉(zhuǎn)錄過程，圖-1 A20 的生物化學(xué)特征

最終導(dǎo)致 PCD。由于 JNK 通路的活化同樣離不開炎癥受體，且 JNK 通路級聯(lián)反應(yīng)的多種成分是 A20 的作用底物，所以 JNK 通路離不開 A20 的調(diào)節(jié)。最初研究認(rèn)為，由 TNFRs 激發(fā)的信號，通過選擇下調(diào)靶向底物，NF-κB 誘導(dǎo)的負(fù)反饋反應(yīng)確保有效下調(diào) JNK 通路（Kucharczak et al., 2003;Wajant et al.,2003; Papa et al., 2004a）。

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本文編號：2786265