【摘要】：目的：A群鏈球菌（Group A streptococcus，GAS）是常見的人類致病菌，能夠引起各種化膿性感染性疾病，包括咽炎、扁桃體炎等輕型感染，以及感染后的自身免疫病、致死率很高的毒素性疾病，如風濕熱、風濕性心臟病、免疫性腦病、牛皮癬、腎小球腎炎以及毒性休克綜合征、猩紅熱等，嚴重威脅人體健康。機體試圖利用免疫防御功能清除細菌，阻斷感染，但由于鏈球菌有強大的免疫逃逸能力，所以鏈球菌感染表現(xiàn)為遷延及反復感染狀態(tài)。目前，研究表明GAS的免疫逃逸表現(xiàn)在多方面，一方面是細菌依靠本身的毒力因子，包括M蛋白、Fba、SpeB等因素進行免疫逃逸；另一方面是GAS通過與宿主的相互作用，消弱或抑制宿主免疫防御功能而進行免疫逃逸。固有免疫是機體的第一道防線，是特異性免疫的基礎，巨噬細胞是一類重要的執(zhí)行固有免疫的細胞，它以模式識別受體識別、結合細菌的病原相關分子模式，通過信號傳導通路致細胞活化，以多種機制殺死和清除細菌。而GAS在免疫逃逸過程中進化出各種策略，挑戰(zhàn)固有免疫細胞的清除作用，上調(diào)宿主細胞免疫負調(diào)節(jié)因子就是其免疫逃逸的重要手段之一。NF-κB通路是巨噬細胞激活的重要通路，調(diào)節(jié)此通路的的免疫抑制分子有多種，如MyD88s、SHIP1、RP105、IRAK-M Tollip、A20、TRAILR、 SOCS-1、NOD2、C5a、Stlr、SIGIRR和RIP3等，這些分子的調(diào)控機制各不相同，但最終都能對NF-κB信號通路起負調(diào)節(jié)作用。本室前期工作已證實，GAS可以誘導鼠巨噬細胞（MΦ）產(chǎn)生高水平的免疫負調(diào)節(jié)因子A20，本研究在此基礎上聚焦于上調(diào)A20表達的GAS菌體成分以及作用機制的研究。 A20為鋅指蛋白，又稱為腫瘤壞死因子α誘導蛋白3(tumor necrosisfactor alpha induced protein3,TNFAIP3)，也稱作腫瘤壞死因子α誘導蛋白A20(tumor necrosis factor, alpha induced protein a20,TNFAIPA20)。作為負調(diào)控因子，A20能在多種組織細胞內(nèi)誘導表達，表達刺激因素包括細胞因子如腫瘤壞死因子、IL-1、CD40等，其他還有佛波醇酯、過氧化氫、細菌和病毒以及它們的代謝產(chǎn)物脂多糖、EB病毒潛伏膜蛋白1等。A20的調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)為對TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、細胞間黏附分子等多種促炎因子的過度釋放以及對細胞凋亡和壞死明顯的抑制作用。 A20在發(fā)揮調(diào)控功能時主要利用其雙重泛素化酶功能，使胞漿中相關信號通路的多種關鍵蛋白分子泛素化，進而被蛋白酶體識別，加速降解，達到抑制信號通路的作用，抑制促炎因子的表達，增加抗炎因子的表達。在NF-κB信號通路中，A20靶向關鍵的上游成分，如RIP1和TRAF6，使它們泛素化降解，最終引起炎癥通路的抑制。本室前期工作雖已證實GAS與MΦ作用后上調(diào)表達A20，但A20的表達變化特征如何？何為誘導A20表達的GAS相關成分？為解釋這些問題，本課題進行了以下一些探索，首先觀察GAS作用于RAW264.7細胞致A20表達的特征，再通過構建M蛋白和SpeB基因缺失菌分析上調(diào)A20表達致免疫逃逸的菌體成分，并通過相應的通路分析初步探索A20調(diào)控的機制。 方法： 1.檢測GAS作用于RAW264.7細胞致A20蛋白表達特征：用3個不同濃度的GAS菌（MOI=10:1、50:1、100:1）感染RAW264.7細胞，設感染后0.5h、2h、4h、6h、8h、12h刺激孔，行Western blot檢測不同濃度GAS菌作用于RAW264.7細胞A20蛋白表達動態(tài)變化特征。 2. GAS致RAW264.7細胞A20表達機制研究： 2.1Real-time PCR和免疫組化法檢測GAS刺激RAW264.7細胞后，炎癥因子TNF-α mRNA和蛋白的表達變化。 2.2用放線菌酮阻斷后再行GAS刺激RAW264.7細胞，免疫組化法檢測TNF-α，Western blot法檢測A20。 2.3用TNFR1抗體阻斷后再行GAS刺激RAW264.7細胞，Western blot檢測A20蛋白的表達變化。 2.4Western blot檢測基因敲除鼠MyD88-BMDM細胞受GAS刺激后A20的表達變化。 3.構建SpeBˉ/-GAS、Mˉ/-GAS基因突變菌：先構建重組同源片段自殺質(zhì)粒pFW5/△SpeB和pFW5/△M，再經(jīng)電轉化構建基因突變菌SpeBˉ/-GAS、Mˉ/-GAS并鑒定。 4. GAS基因突變菌與野生菌作用于RAW264.7細胞致A20及NF-κB通路相關分子的表達差異分析： 4.1wt GAS、SpeBˉ/-GAS、Mˉ/-GAS基因突變菌作用于RAW264.7細胞后，分別用Real-time PCR和Western blot檢測A20mRNA與蛋白表達。 4.2Western blot檢測wt GAS、SpeBˉ/-GAS、Mˉ/-GAS基因突變菌作用于RAW264.7細胞后，NF-κB通路分子TRAF6和P65的表達差異。 4.3Real-time PCR方法分析SpeBˉ/-GAS、Mˉ/-GAS基因突變菌與wt GAS作用于RAW264.7細胞后，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達差異。 5. Western blot檢測wt GAS、SpeBˉ/-GAS、Mˉ/-GAS基因突變菌作用于小鼠BMDM細胞，A20及其調(diào)控的NF-κB通路中TRAF6和P65的表達差異。 結果： 1.GAS菌作用于RAW264.7細胞致A20蛋白表達的特征：低濃度菌量（MOI=10:1）感染時，RAW264.7細胞的A20表達量從感染后2h直至12h維持高水平。中濃度（MOI=50:1）感染，表達高峰在感染后6h，比低濃度出現(xiàn)晚且維持時間短。高濃度（MOI=100:1）感染，A20的表達量在2h內(nèi)雖然有所上升，但表達水平低。 2.A20表達與TNF-α通路的關系：Real-time PCR檢測顯示RAW264.7細胞感染GAS后TNF-α的表達水平隨時間變化逐漸增強(p0.05)；放線菌酮阻斷RAW264.7細胞后再感染GAS菌， TNF-α能被有效阻斷；放線菌酮阻斷RAW264.7細胞后，在GAS菌刺激下A20蛋白表達明顯減少，說明A20是炎癥因子依賴性表達。進一步以TNFR1抗體阻斷RAW264.7細胞，接受GAS刺激后A20蛋白表達明顯低于陽性對照組，但高于正常對照組，提示TNFR1活化通路可以部分誘導A20。 3.MyD88基因敲除鼠的BMDM細胞在GAS菌刺激下，Western blot檢測A20蛋白無表達，提示GAS致巨噬細胞A20表達為MyD88依賴性。 4.成功構建了pFW5/△SpeB與pFW5/△M重組自殺質(zhì)粒，經(jīng)電轉化GAS菌構建了SpeBˉ/-GAS、Mˉ/-GAS基因突變菌并通過了鑒定。用Mˉ/-GAS基因突變菌作用于RAW264.7細胞后，分別用Real-time PCR和Western blot檢測A20mRNA與蛋白表達，與野生菌GAS（wt GAS）作用相比，Mˉ/-GAS使RAW264.7細胞A20mRNA（p0.01）與蛋白表達均下降，而SpeBˉ/-GAS使RAW264.7細胞A20mRNA（p0.01）與蛋白表達呈上升趨勢。 5.不同菌株(wt GAS、Mˉ/-GAS、SpeBˉ/-GAS）致RAW264.7細胞A20表達變化過程中，A20作用通路內(nèi)相應信號分子表達的變化：用wt GAS、Mˉ/-GAS、SpeBˉ/-GAS分別刺激RAW264.7細胞后在1h、2h、4h、6h、8h幾個時間點動態(tài)觀察底物TRAF6及其下游P65蛋白表達，發(fā)現(xiàn)各組內(nèi)TRAF6及P65隨時間進展表達均增加，說明不論成分缺失與否，炎癥反應隨著時間變化逐漸增強。與wt GAS刺激組對比，Mˉ/-GAS刺激組的TRAF6及P65表達處于較高水平，而SpeBˉ/-GAS基因缺失菌TRAF6及P65表達則減少，與缺失菌刺激A20變化吻合。 6.不同菌株(wt GAS、Mˉ/-GAS、SpeBˉ/-GAS）作用于RAW264.7細胞后，細胞因子的表達變化。用Mˉ/-GAS、SpeBˉ/-GAS作用于RAW264.7細胞后，Real-time PCR檢測細胞因子表達：與wt GAS作用比較，Mˉ/-GAS刺激組IL-1β、IL-6mRNA水平明顯高于wt GAS刺激組（p0.01），有顯著差異；TNF-α mRNA的表達水平則比wt GAS刺激組低。而SpeBˉ/-GAS刺激組IL-1β、IL-6、TNF-α的表達與wt GAS刺激組接近。經(jīng)細胞因子的表達變化趨勢分析，發(fā)現(xiàn)細胞因子變化與相應組A20的表達一致，呈負相關。 7.不同菌株(wt GAS、Mˉ/-GAS、SpeBˉ/-GAS）致鼠源BMDM細胞的A20及TRAF6、 P65蛋白表達差異。分別行Western blot檢測分析，在2h、4h、6h幾個時間點動態(tài)觀察A20及TRAF6、 P65蛋白表達差異，與野生菌刺激組相比，各組BMDM細胞的A20及TRAF6、 P65蛋白表達特性及趨勢與RAW264.7細胞相同。 結論： 1.放線菌酮阻斷實驗證明A20表達為細胞因子依賴性。TNFR1抗體阻斷實驗證明A20表達部分依賴TNFR1途徑。 2.A20誘導表達為MyD88依賴性。 3.M蛋白能促使A20的表達，有助于GAS免疫逃逸；而SpeB則沒有此功能。TRAF6及P65檢測、細胞因子檢測、GAS感染BMDM細胞實驗均支持以上結論。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【圖文】：

ase γ (IKKγ), A20 binding inhibitor of NF κB activation 1 (ABI ABIN2，這些分子通過與 A20 結合實現(xiàn)它們之間的相互作用。A20 enzymes RING-finger protein 11 (RNF11) and ITCH 及與自身結合的未確定。另外，C103 和 ZF4 模序還有降解 E2 酶的作用[1]，ZF6- Z溶酶體。A20 也要經(jīng)歷轉錄后修飾，如靠 IKKβ 的磷酸化，此功在于 OTU 與 ZF1 之間的區(qū)域； 在人體內(nèi)，paracaspase MALT10 的 ZF1 和 ZF2 之間區(qū)域結合，降解 A20；鼠體內(nèi)降解 A20 的部位定，可能是在 ZF3 和 ZF4 之間的區(qū)域。二、A20 的基因結構與調(diào)節(jié)功能A20 的基因分析見表-1，研究結果表明，A20 基因 5’上游序列存在度保守的潛在轉錄因子結合位點，如 HSF、Oct-1、AP-1 等。HSP克基因，在應激反應中與相應啟動子結合，開啟基因的轉錄過程，圖-1 A20 的生物化學特征

最終導致 PCD。由于 JNK 通路的活化同樣離不開炎癥受體，且 JNK 通路級聯(lián)反應的多種成分是 A20 的作用底物，所以 JNK 通路離不開 A20 的調(diào)節(jié)。最初研究認為，由 TNFRs 激發(fā)的信號，通過選擇下調(diào)靶向底物，NF-κB 誘導的負反饋反應確保有效下調(diào) JNK 通路（Kucharczak et al., 2003;Wajant et al.,2003; Papa et al., 2004a）。

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