【摘要】： 病理學(xué)研究表明,至少20種淀粉樣蛋白與神經(jīng)變性疾病、糖尿病等頑疾密切相關(guān),如阿爾茨海默氏病、II型糖尿病、帕金森綜合癥以及亨廷頓舞蹈癥等。此外,因蛋白質(zhì)變性而形成的聚集體,將給蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)、貯藏與運(yùn)輸帶來極大困難,同時對蛋白質(zhì)藥物的安全使用帶來風(fēng)險,是生物醫(yī)藥領(lǐng)域中亟待解決的技術(shù)問題。本文以模式藥物蛋白胰島素為研究對象,結(jié)合現(xiàn)代生物物理檢測手段,對胰島素聚集機(jī)理進(jìn)行驗(yàn)證,建立新型淀粉樣纖維體表征檢測技術(shù),提出氨水-過氧化氫兩步法途徑聚集淀粉樣纖維和再生胰島素二硫鍵,并開展了胰島素低聚體和淀粉樣纖維的相關(guān)抑制工作。具體研究內(nèi)容和結(jié)論如下: 第一,綜合利用圓二色譜、熒光光譜、動態(tài)光散射、電子顯微鏡和太赫茲時域光譜多種現(xiàn)代檢測技術(shù),多尺度表征胰島素淀粉樣纖維化過程中二級、三級、四級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變與狀態(tài)密度的改變,驗(yàn)證了胰島素聚集機(jī)理;首次利用太赫茲時域光譜儀研究和檢測蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化行為,獲得0.2 THz~2.0 THz頻率區(qū)的太赫茲吸收譜和折光系數(shù)變化曲線,建立了一種利用太赫茲時域光譜技術(shù)對淀粉樣蛋白質(zhì)進(jìn)行快速、無損的檢測方法。 第二,嘗試使用NH_3-H_2O_2兩步法對胰島素淀粉樣纖維進(jìn)行解聚與單體二硫鍵斷裂和恢復(fù),并對比NH_3-H_2O_2耦合法,確定了還原-氧化過程的關(guān)鍵因素;提出氨水對胰島素淀粉樣纖維解聚的機(jī)理模型,指出氨水作用機(jī)制為通過改變蛋白周圍親疏水環(huán)境以及破壞固有氫鍵作用,逐步釋放單個胰島素分子。 第三,對比不同類型多羥基化合物對胰島素聚集與淀粉樣纖維化過程的影響,分別解釋了原花青素、白藜蘆醇和海藻糖加入20% HAc溶液和20% HAc-0.1 M NaCl溶液體系后,胰島素聚集熒光動力學(xué)和原纖/纖維的結(jié)構(gòu)形貌改變;指出抑制能力順序:原花青素白藜蘆醇海藻糖,分別起到抑制成核、阻礙生長和無明顯抑制的作用。 第四,采用532 nm波長的激光,通過抑制胰島素成核機(jī)理,阻礙成熟纖維形成;特別指出在使用動態(tài)光散射儀和ThT熒光光譜儀對樣品進(jìn)行在線測量時,應(yīng)注意所測樣品是否易于發(fā)生光化學(xué)反應(yīng),如發(fā)生聚集和解聚。本實(shí)驗(yàn)亦證明了連續(xù)激光照射將為胰島素提供一個相對穩(wěn)定的溶液環(huán)境,有利于維持胰島素低聚體狀態(tài),關(guān)于自由基作用機(jī)理方面具有一定的研究前景。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R341
【圖文】：

大時具有結(jié)構(gòu)和構(gòu)象穩(wěn)定性。一旦環(huán)境發(fā)生改變，蛋白質(zhì)將過調(diào)整側(cè)鏈殘基相互作用到達(dá)另一個穩(wěn)定狀態(tài)。其中，疏水核重要的作用，同時靜電作用(鹽鍵)、二硫鍵形成和發(fā)生在酪氨的偶極離子相互作用都會影響蛋白質(zhì)折疊過程和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。子間相互作用酸順序決定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，而結(jié)構(gòu)又決定其生理功能。因象的作用力主要是蛋白質(zhì)主鏈上氨基酸殘基之間的相互作用，液環(huán)境的作用。它是由一些弱相互作用或稱非共價鍵組成，包、范德華力和靜電作用(示于圖 1-2)。此外，二硫鍵和芳香作象方面也起著重要作用，蛋白質(zhì)三級和四級結(jié)構(gòu)的形成就來源作用力。

tural-AZ[65])，對低聚體抑制劑的開發(fā)顯然更具有研究意義。因認(rèn)為是當(dāng)前抑制蛋白質(zhì)聚集和治療淀粉樣疾病方法中最具前制劑。它物理方法分解淀粉樣纖維 1914 年諾貝爾獎獲得者 P. W. Bridgman 發(fā)現(xiàn)高壓導(dǎo)致蛋白去后，大量研究結(jié)果表明靜水壓能夠破壞穩(wěn)定蛋白自然狀態(tài)的非隨著蛋白質(zhì)水溶液體系體積減小和蛋白質(zhì)不斷去折疊的過程，白質(zhì)聚集體的體外解聚并重新折疊成為可溶性蛋白[66-68]。為了維穩(wěn)定性和聚集熱力學(xué)，研究者對靜水壓改變和溫度擾動進(jìn)究結(jié)果見圖 1-4，說明了低溫高水壓對蛋白質(zhì)聚集體解聚的熱了穩(wěn)定蛋白質(zhì)有效途徑。

時間為 21 h、46 h、56 h、71 h 和 73 h 的粒徑分布。反應(yīng)開始胰島素在 20%乙酸中以主要以單體存在；反應(yīng) 21 h 后，溶液中同時存在兩種尺寸分布的顆�！獑误w/低聚體(水力學(xué)半徑為 1.8 nm/5.6 nm±0.1 nm)和胰島素原纖(水力學(xué)半徑為177.8 nm ±0.1 nm)；從 21 h~56 h，胰島素粒徑分布無明顯變化，此時處于成核后期和聚集伸長期，逐漸形成胰島素成熟纖維(粒徑>1000 nm，由上千個胰島素單體組成)，從而低聚體和胰島素原纖的光散射強(qiáng)度均略微減��；聚集時間為 71 h時，溶液中出現(xiàn)大量胰島素低聚體(水力學(xué)半徑為 5.6 nm)，而達(dá)到 73 h 時迅速減少，形成胰島成熟纖維，這一轉(zhuǎn)變與圓二色結(jié)果一致。根據(jù) DLS 數(shù)據(jù)，可知聚集 21 h，胰島素以單體(1.8 nm)、低聚體(5.6 nm)和原纖(177.8 nm)狀態(tài)存在。Stefan 等發(fā)現(xiàn)在 60oC 下 HCl 溶液中，胰島素纖維化過程滯后期為~30 h，并且胰島素初始粒徑大約為 3 nm，對應(yīng)于胰島素二聚體，生長期不斷出現(xiàn)粒徑為 250 nm 的胰島素原纖[81]。不同的溶液環(huán)境決定了蛋白質(zhì)初始結(jié)構(gòu)和低聚狀態(tài)，隨著聚集時間的增加，將會獲得不同尺寸的粒徑分布。因此，胰島素纖維化過程受溶液環(huán)境影響。

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2782389