【摘要】：一、抗rhG-CSF噬菌體抗體庫的構(gòu)建和鑒定 目的 構(gòu)建抗rhG-CSF噬菌體抗體文庫，以探索制備rhG-CSF病診療用單克隆抗體的新方法。方法用文庫構(gòu)建試劑盒，以健康人外周血淋巴細胞為材料，建立噬菌體抗體文庫，并對其進行鑒定。結(jié)果 構(gòu)建完成了一滴度為6.42×10~(10)cfu／ml的噬菌體抗體庫。結(jié)論 rhG-CSF噬菌體抗體庫的建立為對文庫進行進一步的篩選、表達奠定了基礎(chǔ)。 二、抗rhG-CSF噬菌體抗體庫的篩選和陽性克隆的鑒定 目的 研制rhG—CSF的單鏈抗體。 方法 用rhG-CSF抗原包板，對己構(gòu)建的抗rhG-CSF噬菌體抗體庫進行3輪富集，然后用ELISA法從富集的次級抗體庫中篩選陽性克隆，最后借助ELISA、SDS-PAGE和Western印跡等方法，根據(jù)克隆表達產(chǎn)物與其它4種抗原反應(yīng)的情況，進行特異性鑒定。 結(jié)果 從隨機挑取的80個克隆中篩選到陽性克隆6個，經(jīng)交叉篩選和鑒定最終獲得特異性抗rh6-CSF陽性克隆2個。 結(jié)論 用固相富集和ELISA篩選法可以從抗體庫中有效地篩選到抗rhG-CSF的陽性克隆，獲得的抗體克隆可用于抗rhG-CSF單鏈抗體的制備。 三、抗rhG-CSF噬菌體抗體基因結(jié)構(gòu)分析 目的 對獲得的抗rhG-CSF的抗體克隆進行基因分析。方法 將2株陽性克隆抗體基因進行測序，并用NCBI和Ig Blast Antibody of Immunoglobulin sequences中的軟件，對DNA序列和由其推導(dǎo)的氨基酸序列進行分析，并對其二級結(jié)構(gòu)進行了模擬。結(jié)果 G9和G32陽性克隆抗體基因的長度分別為708bp和732bp，輕鏈和重鏈可變區(qū)基因與人免疫球蛋白基因有高度的同源性。推導(dǎo)的氨基酸序列具有典型的抗體輕、重鏈可變區(qū)特征。對2株克隆抗體基因二級結(jié)構(gòu)進行模擬，結(jié)果顯示以β-折疊和轉(zhuǎn)角為主的平行肽鏈形成片層樣結(jié)構(gòu)，均符合抗體的基本構(gòu)型。結(jié)論 G9、G32陽性克隆外源基因均屬于人免疫球蛋白可變區(qū)基因。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R392
【圖文】：

圖1.抗體的可變區(qū)片段示意圖是在ScFv的一端加上一個雙聚化結(jié)構(gòu)，其中效果較好并已進行了體內(nèi)應(yīng)用研究的有Minibody。這是將19分子中的CH3拼接在ScFv的梭基端，通過CH3形成。、’、、

人源性抗體庫制備及構(gòu)建程序示意圖

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文5.3不經(jīng)免疫制備抗體抗體庫技術(shù)可以在體外模擬體內(nèi)的抗體生成過辟了不經(jīng)免疫制備抗體的新時代。體內(nèi)抗體生成的關(guān)鍵有三點:多樣細胞群體(Bcenrepertiore);克隆選擇;親和力成熟�？贵w庫技術(shù)的強大篩選能力和上節(jié)所述的抗體性能改良能力已基本解決了后兩點，不經(jīng)免疫制備抗體的關(guān)鍵就在于第一點:即構(gòu)建性能優(yōu)良的噬菌體抗這里需要考慮二個參數(shù):大容量和多樣性。Uf七邵d公成f:ila:mentou烏phage

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本文編號：2781452