【摘要】：一、抗rhG-CSF噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建和鑒定 目的 構(gòu)建抗rhG-CSF噬菌體抗體文庫(kù)，以探索制備rhG-CSF病診療用單克隆抗體的新方法。方法用文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，以健康人外周血淋巴細(xì)胞為材料，建立噬菌體抗體文庫(kù)，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果 構(gòu)建完成了一滴度為6.42×10~(10)cfu／ml的噬菌體抗體庫(kù)。結(jié)論 rhG-CSF噬菌體抗體庫(kù)的建立為對(duì)文庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步的篩選、表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。 二、抗rhG-CSF噬菌體抗體庫(kù)的篩選和陽(yáng)性克隆的鑒定 目的 研制rhG—CSF的單鏈抗體。 方法 用rhG-CSF抗原包板，對(duì)己構(gòu)建的抗rhG-CSF噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行3輪富集，然后用ELISA法從富集的次級(jí)抗體庫(kù)中篩選陽(yáng)性克隆，最后借助ELISA、SDS-PAGE和Western印跡等方法，根據(jù)克隆表達(dá)產(chǎn)物與其它4種抗原反應(yīng)的情況，進(jìn)行特異性鑒定。 結(jié)果 從隨機(jī)挑取的80個(gè)克隆中篩選到陽(yáng)性克隆6個(gè)，經(jīng)交叉篩選和鑒定最終獲得特異性抗rh6-CSF陽(yáng)性克隆2個(gè)。 結(jié)論 用固相富集和ELISA篩選法可以從抗體庫(kù)中有效地篩選到抗rhG-CSF的陽(yáng)性克隆，獲得的抗體克隆可用于抗rhG-CSF單鏈抗體的制備。 三、抗rhG-CSF噬菌體抗體基因結(jié)構(gòu)分析 目的 對(duì)獲得的抗rhG-CSF的抗體克隆進(jìn)行基因分析。方法 將2株陽(yáng)性克隆抗體基因進(jìn)行測(cè)序，并用NCBI和Ig Blast Antibody of Immunoglobulin sequences中的軟件，對(duì)DNA序列和由其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析，并對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬。結(jié)果 G9和G32陽(yáng)性克隆抗體基因的長(zhǎng)度分別為708bp和732bp，輕鏈和重鏈可變區(qū)基因與人免疫球蛋白基因有高度的同源性。推導(dǎo)的氨基酸序列具有典型的抗體輕、重鏈可變區(qū)特征。對(duì)2株克隆抗體基因二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，結(jié)果顯示以β-折疊和轉(zhuǎn)角為主的平行肽鏈形成片層樣結(jié)構(gòu)，均符合抗體的基本構(gòu)型。結(jié)論 G9、G32陽(yáng)性克隆外源基因均屬于人免疫球蛋白可變區(qū)基因。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

圖1.抗體的可變區(qū)片段示意圖是在ScFv的一端加上一個(gè)雙聚化結(jié)構(gòu)，其中效果較好并已進(jìn)行了體內(nèi)應(yīng)用研究的有Minibody。這是將19分子中的CH3拼接在ScFv的梭基端，通過(guò)CH3形成。、’、、

人源性抗體庫(kù)制備及構(gòu)建程序示意圖

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文5.3不經(jīng)免疫制備抗體抗體庫(kù)技術(shù)可以在體外模擬體內(nèi)的抗體生成過(guò)辟了不經(jīng)免疫制備抗體的新時(shí)代。體內(nèi)抗體生成的關(guān)鍵有三點(diǎn):多樣細(xì)胞群體(Bcenrepertiore);克隆選擇;親和力成熟。抗體庫(kù)技術(shù)的強(qiáng)大篩選能力和上節(jié)所述的抗體性能改良能力已基本解決了后兩點(diǎn)，不經(jīng)免疫制備抗體的關(guān)鍵就在于第一點(diǎn):即構(gòu)建性能優(yōu)良的噬菌體抗這里需要考慮二個(gè)參數(shù):大容量和多樣性。Uf七邵d公成f:ila:mentou烏phage

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本文編號(hào)：2781452