【摘要】：甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)屬于血清C型凝集素,是機體天然免疫的重要分子之一,這種高度保守的糖蛋白主要由肝細胞合成并以三聚體亞單位組成的多種寡聚體形式在血清中循環(huán),其寡聚體形式可廣泛識別多種病原體表面的糖結(jié)構(gòu),并通過激活2個MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MBL associated serine proteases, MASP-1, MASP-2)以不依賴于抗體和Clq的方式激活補體系統(tǒng),發(fā)揮細胞溶破和間接調(diào)理功能。目前已知的MBL受體包括吞噬細胞表面膠凝素受體,能通過二者的結(jié)合而起直接調(diào)理作用,并在調(diào)節(jié)炎癥和啟動細胞調(diào)亡過程中發(fā)揮作用。MBL、Clq和SP-A、SP-D屬于可溶性模式識別受體(Patteren Recognition Receptor, PRR),是防御性膠原家族成員。而PRR的配體稱為病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-Associated Molecule Pattern,PAMP),是一組或幾大組病原體所共有、對其生存絕對必要且宿主機體沒有的保守成分。MBL能夠以其球狀羧基端識別病原體表面特異性PAMP,引發(fā)機體迅速有效的保護性免疫應答。此外,MBL對病原體具有廣譜識別作用,可結(jié)合免疫球蛋白；參與對凋亡細胞的吞噬以及MBL依賴的Th細胞活化和細胞介導的細胞毒作用。近年發(fā)現(xiàn),大鼠MBL可以刺激肝臟Kupffer細胞對大腸桿菌及金黃色葡萄球的吞噬；重組人MBL可促進單核巨噬細胞株THP-1對大腸桿菌的吞噬。另一方面,細胞因子和抗原提呈細胞在決定感受到危險信號后所發(fā)生的免疫應答的類型和強度時具有重要作用。MBL可與單核細胞(Monocyte, Mo)和樹突狀細胞(Dendritic cells, DC)結(jié)合,調(diào)節(jié)細胞因子的分泌,抑制LPS/CD14誘導的單核細胞釋放炎性細胞因子TNF-α,同時上調(diào)抑制性細胞因子的分泌；抑制DC-SIGN介導的對T細胞的感染。研究表明,膠凝素家族成員肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白SP-A、SP-D亦可與多種免疫細胞如單核細胞、樹突狀細胞、T細胞結(jié)合,在天然免疫和獲得性免疫應答中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能,如增強吞噬細胞表面受體的表達,調(diào)節(jié)細胞因子和自由基的釋放,清除自身凋亡細胞。 樹突狀細胞是機體內(nèi)功能最強的專職抗原提呈細胞,且能夠通過分泌特異性的細胞因子和與T、B細胞的相互作用有效啟動免疫系統(tǒng)和介導免疫調(diào)節(jié)。研究者最初對于DC的認識并無抗原攝取功能,但隨后發(fā)現(xiàn)DC在吞噬活性、遷移能力和介導獲得性免疫應答系統(tǒng)方面皆具有其精確的階段性調(diào)控機制,能夠有效地刺激T淋巴細胞和B淋巴細胞的活化,從而啟動和調(diào)節(jié)獲得性免疫應答,故在免疫應答的誘導中具有獨特的地位。但是由于DC在人體內(nèi)的數(shù)量有限且功能復雜多樣,對于其體外分化發(fā)育、抗原提呈、功能調(diào)控等諸多方面的研究存在著許多空白。最初的體外實驗發(fā)現(xiàn),人源未成熟DC可以誘導異體抗原反應性Treg的生成,而新近研究表明,在機體處于感染狀態(tài)時,由病原體釋放的Toll樣受體(Toll like receptor, TLR)激動劑能夠在Mo分化早期抑制其分化為常規(guī)未成熟DC,而發(fā)展為CD14+CD1a-的調(diào)節(jié)性細胞亞群。此外,應用Yssel's培養(yǎng)基能夠?qū)o來源DC誘導為以CDla-產(chǎn)生IL-10而無IL-12分泌為特征的免疫抑制型DC亞群,同時發(fā)現(xiàn),新分離單核細胞的初始24h是改變DC后期表型的重要階段,此后再加入刺激因素,DC將傾向于向常規(guī)方向分化。 其中,CD1家族分子在體內(nèi)抗微生物感染過程中主要負責脂類抗原提呈,在Mo細胞來源DC的分化早期高表達,是DC分化發(fā)育中的標志性表面分子。CDla的表達往往適應于DC的功能需要,細胞捕獲抗原時常見CDla高表達,當細胞處于抗原提呈狀態(tài)時,其表達水平相應下調(diào)。病理條件下,CDla往往表達在CD83+的DC亞群中,已有研究證實,CD1蛋白是誘導有效細胞免疫的必要條件,其表達與麻風病分型直接相關(guān)。CD1+CD83+單核細胞來源的DC對于鑒別Mo的分化方向、活化CD1限制性T細胞起重要作用,且在臨床治療及預后監(jiān)測中具有指導性意義。 本課題通過體外分離培養(yǎng)人外周血單核細胞并誘導其分化為DC,在各實驗組中加入MBL及其它刺激因素,分別在DC的早期分化階段、未成熟階段和成熟階段連續(xù)觀察細胞形態(tài),檢測細胞表面分子標志、細胞功能及其相關(guān)機制,闡明MBL在此過程中的作用。初步揭示了MBL可通過調(diào)節(jié)單核細胞的分化方向,促進CD14+CD1alow調(diào)節(jié)性樹突狀細胞亞群的生成,并影響樹突狀細胞各發(fā)育階段的表型和功能,從而有效聯(lián)系機體天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng),最終發(fā)揮抵抗病原體感染和調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫應答強度的雙重作用。 第一章MBL對人外周血單核細胞誘導為調(diào)節(jié)性DC的研究 CDla分子是一類具有與MHCI和MHCII高度同源性的兼具抗原肽的識別與提呈功能的非典型抗原提呈分子。多數(shù)研究表明,只有郎格罕斯細胞(LC)和某些皮膚DC及胸腺細胞能夠表達CDla,此外,CDla的表達水平與DC的成熟狀態(tài)密切相關(guān),未成熟DC高表達CDla,具且有較強的抗原捕獲能力,而隨著DC在抗原刺激下的逐步成熟,其抗原提呈能力提高而捕獲抗原能力下降,此時CDla的表達也隨之減少。 本實驗中,取健康人外周血采用密度梯度離心法和磁珠分選獲得高純度單核細胞,聯(lián)合應用IL-4和GM-CSF成功誘導出大量DC細胞。在單核細胞向DC誘導分化的早期階段(d0),分別加入MBL和無關(guān)蛋白HSA,經(jīng)常規(guī)培養(yǎng),分別在第2天和第5天收獲細胞,采用流式細胞術(shù)檢測細胞表面Mo標志性分子CD14、CDllb的表達水平,同時檢測DC標志性共刺激分子CD80、CD40、CD86、 CDla、CD83以及MHCⅡ類分子HLA-DR的表達,并通過PCR和ELISA分別在基因和蛋白水平檢測MBL對細胞因子表達譜的影響。 結(jié)果表明,MBL刺激組獲得DC細胞數(shù)明顯少于對照組(F=7.169,P=0.026,多重比較結(jié)果P0.01),且無凋亡現(xiàn)象發(fā)生,提示MBL可能以非調(diào)亡方式抑制單核細胞向常規(guī)DC方向的分化,同時我們觀察到,該DC前體細胞持續(xù)表達單核細胞標志CD14,上調(diào)CD11b表達,而常規(guī)DC標志分子CDla低表達,CD80、 CD40和HLA-DR水平均下調(diào)(FCD80=0.216, PCD80=0.667, FCD40=0.242, PCD40=0.649,多重比較P CD800.05, P CD400.05; FHLA-DR/d2=3.582, P HLA-DR/d2=0-095,多重比較P HLA-DR/d20.05; FHLA-DR/d5=3.113, PHLA-DR/d5=0.118,多重比較PHLA-DR/d50.05),在此檢測期內(nèi)CD83僅少量表達。該細胞亞群以分泌IL-10、IL-6為特征(FIL-10=4.890, PIL-10=0.055, FIL-6=4.111, PIL-6=0.075,多重比較P IL-100.01, P IL-60.01),幾乎無IL-12分泌(FIL-12=2.133, PIL-12=0.200,多重比較P IL-120.01),,幾乎無IL-12分泌,因此推測在DC分化早期加入MBL,可能誘導出與常規(guī)DC表型和功能不同的DC細胞亞群。 此部分工作首先為后續(xù)的機制研究提供了充足穩(wěn)定的MBL蛋白,經(jīng)鑒定,MBL純度較高且能夠保持其天然生物活性,采用磁珠分選獲得了高度純化的單核細胞并具備良好的細胞活力用于DC細胞體外誘導,該誘導方法穩(wěn)定、可重復性高,保證了實驗所需的DC細胞來源。同時,初步確定了MBL可能誘導早期單核細胞分化為調(diào)節(jié)性DC亞群,針對這一現(xiàn)象,完成了對DC細胞表型和細胞因子表達特征的檢測。 第二章MBL對單核細胞誘導為調(diào)節(jié)性DC亞群的機制及功能的初步研究 最近研究表明,漿細胞來源DC分泌低水平IL-12并促進T細胞向Th2亞群分化,而單核細胞來源DC則通過產(chǎn)生高水平IL-12誘導T細胞向Thl型分化。由于該研究中的DC細胞來源于不同的細胞前體,而同一細胞群體是否能分化出功能各異并且分泌不同細胞因子的DC亞群尚不得而知。Yssel等發(fā)現(xiàn)在誘導人外周血單核細胞向DC分化的常規(guī)培養(yǎng)基中加入胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞麻油酸、油酸及棕櫚酸能夠促使單核細胞分化為CD14+DC,該細胞亞群即使在LPS和IFN-γ的刺激下仍然表現(xiàn)為CDla-并且不分泌IL-12,研究人員將該類DC細胞定義為mDC2,并且證實,其顯著特征為CDla—和缺乏IL-12表達,并且能夠調(diào)節(jié)T細胞的分化方向,促進產(chǎn)生Th0/Th2細胞。髓系DC的分化往往依賴于GM-CSF的激活,GM-CSF通過特異性非受體酪氨酸激酶JAKs和信號傳導和激活轉(zhuǎn)錄因子STAT,尤其是JAK2和STAT5介導的信號通路發(fā)揮作用。 由此,本實驗將該細胞亞群與T細胞混合培養(yǎng),結(jié)果表明在分化早期受到MBL刺激的未成熟DC具有抑制T細胞增殖活化,抑制其IFN-y分泌的功能,結(jié)果有統(tǒng)計學差異(F1：5=2.280,P1：5=0.183,多重比較P1：50.01；F1:5(anti-CD3/CD28):=8.544, P1:5(anti-CD3/CD28)=0.018,多重比較P1:5(anti-CD3/CD28)0.05, F1:20(anti-CD3/CD28)=3.527, P1:20(anti-CD3/CD28)=0.097,多重比較Pi:20(anti-CD3/CD28)0-05)。CDla低表達和IL-12缺乏影響這類細胞的抗原提呈功能,但是并不影響其對抗原的攝取能力。同時,通過Westernblot信號通路分析,發(fā)現(xiàn)MBL可顯著抑制STAT5、JNK表達以及胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERKl磷酸化水平,而刺激PU.1、STAT3活性增強,由此證實了粒細胞巨噬細胞集落刺激因子依賴性STAT5/JAK2通路可能為MBL的作用靶點,從而調(diào)控細胞表型及其細胞因子表達譜。此外,實驗證實該DC細胞亞群在LPS刺激下仍能夠分化為CD83+DC。 第三章MBL對人單核細胞來源DC成熟的影響及機制的初步研究 在本實驗室已有DC研究基礎(chǔ)上,本部分實驗深入探索MBL對人單核細胞來源DC成熟的影響及其機制。首先常規(guī)誘導培養(yǎng)DC,在第5天獲得表型和功能穩(wěn)定的未成熟DC細胞(imDC),繼續(xù)培養(yǎng)2天,其中實驗組加入MBL,在相同培養(yǎng)條件下加入HSA作為無關(guān)蛋白組,在第7天收集成熟DC及培養(yǎng)上清,采用流式細胞術(shù)、ELISA,在細胞分子水平分別檢測MBL對人單核細胞來源的DC成熟的影響,并通過Western Blot在蛋白水平對刺激因素靶向調(diào)控的信號通路機制予以證實。結(jié)果提示,在天然免疫識別分子MBL存在的條件下,DC表面分子CD83、CD86、CD80、CD40和MHCⅡ類分子HLA-DR的表達均上調(diào),且能促進同種異體非抗原特異性T細胞增殖。與DC前體細胞向未成熟DC分化的作用相反,MBL在未成熟DC向成熟DC發(fā)育的過程中刺激STAT5表達,抑制STAT3和SOCS活化,上清中IL-12、表達顯著增加(FIL-12=1.468,PIL-12=0.295,多重比較P＜0.05), TNF-α分泌無統(tǒng)計學差異(FTNF-α=1-049, PTNF-α=0.422,多重比較P=0.973)。提示MBL促進未成熟DC向成熟DC的轉(zhuǎn)化,通過影響抗原提呈細胞在其各個發(fā)展階段的功能,調(diào)節(jié)天然免疫應答強度,最終指導人體的獲得性免疫系統(tǒng)的應答。 綜上所述,MBL作為識別和清除入侵病原體的重要防御性分子,在發(fā)揮宿主天然免疫應答的作用之外,我們的工作證實了MBL能夠通過調(diào)節(jié)APC的分化發(fā)育和功能而參與獲得性免疫應答,尤其能夠在Mo向DC分化早期影響其分化方向,在此特定的發(fā)育階段內(nèi)促進調(diào)節(jié)性DC亞群的形成。這類CD14+CD1alowDC細胞以分泌IL-10、IL-6,低水平分泌IL-12為其特征,低表達多種表面共刺激分子,負向調(diào)節(jié)初始T細胞應答。此外,我們通過對其分子機制和信號傳導通路的分析,初步揭示了MBL調(diào)節(jié)DC發(fā)育的雙重作用,可能是MBL作為天然免疫防御蛋白在感染等病理條件下參與調(diào)控機體的免疫應答強度以及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展的機制之一。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2781109