【摘要】：脂多糖結合蛋白(LBP)是存在于正常人和動物血清中的一種糖蛋白,屬于I型急性期反應蛋白,與脂多糖(LPS)的類脂A部分具有高度親和性。LBP具有致炎和抗炎的雙重作用。LBP既可將LPS多聚體轉換為單聚體,加速LPS與其受體CD14結合,顯著放大LPS的致炎作用;也可加速LPS與靶細胞膜上的清除受體結合,使LPS被靶細胞清除;還可催化LPS與脂蛋白結合,后者可中和LPS的生物學活性,加速體內(nèi)LPS的清除。LBP的不同作用可能是由不同功能位點決定的。當LBP的某一功能位點與LPS的類脂A結合時,表現(xiàn)為對LPS的增敏作用;而當另一功能位點與LPS的類脂A結合時,則可增強LPS的內(nèi)化,表現(xiàn)為對LPS的抑制性調(diào)理作用。本實驗應用噬菌體呈現(xiàn)技術研究LBP的致炎功能位點和抗炎功能位點,并獲得具有抑制LBP致炎活性的可溶性多肽。 方法: 1. 采用經(jīng)典的親和富集法對噬菌體隨機12肽庫進行4輪親和篩選, 以LPS為靶分子,前2輪采用酸洗脫,第3、4輪采用LBP競爭性洗脫,獲得可與LBP競爭性結合LPS的噬菌體克隆。應用結合實驗和競爭抑制實驗進一步確證。 2. 應用細胞因子生成抑制實驗,即通過ELISA法測定人外周血單個核細胞培養(yǎng)上清中TNFα含量,對篩選出的噬菌體克隆進行功能性篩選,獲得具有阻斷LBP致炎作用的噬菌體克隆。通過流式細胞術觀察LPS的內(nèi)化,獲得具有阻斷LBP抗炎作用的噬菌體克隆。 3. 將獲得的噬菌體克隆進行DNA測序,根據(jù)噬菌體克隆基因中所插入的外源DNA序列推導出呈現(xiàn)的外源多肽氨基酸序列。應用Blast軟件將多肽序列與LBP分子的一級結構序列比較分析,對LBP的致炎和抗炎功能位點進行定位。 4. 根據(jù)獲得的具有阻斷LBP致炎作用的噬菌體克隆呈現(xiàn)的外源多肽序列,采用FMOC固相合成法化學合成具有阻斷LBP致炎活性的游離型多肽。 5. 用細胞因子生成抑制實驗檢測合成多肽的抗炎活性。 結果: 1. 采用親和篩選方法,以LPS為靶分子,經(jīng)過2輪篩選,從噬菌體隨機12肽庫 WP=11 中獲得了可與LPS結合的噬菌體克隆。再經(jīng)過2輪LBP競爭性篩選,獲得了可與LBP競爭性結合LPS的噬菌體克隆。 2. 從獲得的可與LBP競爭性結合LPS的噬菌體肽庫中隨機挑取100個噬菌體克隆,進行結合實驗和競爭抑制實驗。結合實驗發(fā)現(xiàn)100個克隆中有72個克隆與LPS有較高的結合活性,進一步的競爭抑制實驗表明其中16個噬菌體克隆具有與LBP競爭結合LPS的活性,進一步進行功能篩選。 3. 細胞因子生成抑制實驗發(fā)現(xiàn),9個噬菌體克隆可顯著抑制LBP增敏LPS誘導PBMC分泌TNFα 的作用; LPS內(nèi)化抑制實驗表明,這9個噬菌體克隆均無抑制LBP增強LPS內(nèi)化作用的活性,其展示肽具有抑制LBP致炎作用的活性。根據(jù)上述9個噬菌體克隆基因中插入的外源DNA序列推導出呈現(xiàn)的多肽序列,這9個噬菌體克隆融合多肽的核心序列為WKXRKXFXKXXG,LBP分子一級結構中有一個與多肽序列相似的序列,位于LBP分子的91-102位氨基酸WKVRKSFFKLQG,LBP的91-102位氨基酸片段可能為其致炎功能位點。 4. LPS內(nèi)化抑制實驗發(fā)現(xiàn),3個噬菌體克隆具有抑制LBP增強LPS內(nèi)化作用的活性;細胞因子生成抑制實驗表明,這3個噬菌體克隆均無抑制LBP增敏LPS誘導PBMC分泌TNFα 的作用,這3個噬菌體克隆所展示的融合多肽具有抑制LBP抗炎作用的活性。這3個噬菌體克隆融合肽DNA序列一致,推導融合表達的12肽序列為FHTRWNYWPYLH,可以模擬LBP的抗炎功能位點。LBP分子一級結構中沒有與FHTRWNYWPYLH相似的序列,提示該序列可能是LBP與LPS結合的一個模擬位點,而不是線性位點。 5. 應用FMOC固相合成法成功合成LBP致炎活性抑制肽,多肽序列為LBP91-102氨基酸序列WKVRKSFFKLQG-NH2,純度在95%以上,分子量1523.6,與理論值相符。合成的LBP致炎作用抑制肽可顯著抑制LBP增敏LPS誘導PBMC分泌TNFα 的活性。 結論: 1. 本研究成功的從噬菌體隨機12肽庫中篩選獲得了可與LBP競爭結合LPS的噬菌體克隆。 2. 篩選獲得的具有特異抑制LBP致炎作用的噬菌體克隆展示肽的核心序列為WKXRKXFXKXXG,與LBP分子的91-102位氨基酸WKVRKSFFKLQG有明顯同源性,LBP的91-102位氨基酸序列WKVRKSFFKLQG可能為其致炎功能位點。 3. 篩選得到的具有特異抑制LBP抗炎作用的噬菌體克隆展示肽的序列為 WP=12 FHTRWNYWPYLH,可以模擬LBP的抗炎功能位點。該序列與LBP分子一級結構同源性低,提示FHTRWNYWPYLH可能是LBP與LPS結合的一個模擬表位,可以模擬LBP的抗炎功能位點。 4. 應用FMOC固相法成功合成12肽WKVRKSFFKLQG-NH2,此多肽具有顯著抑制LBP增敏LPS誘導PBMC分泌TNFα 的活性。 上述研究研究結果對于闡明LBP在LPS所致內(nèi)毒素血癥中的分子結構基礎,為進一步研究內(nèi)毒素血癥中致炎和抗炎的平衡關系奠定基礎,并為內(nèi)毒素血癥的防治探索新途徑。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346
【圖文】：

(4). TNFαELISA 檢測方法同上。（三）、統(tǒng)計學處理各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 ( x±s)表示，采用 SPSS10.0 統(tǒng)計軟件進行方差分析和t 檢驗，P㩳0.05 為相差顯著。結 果1. LBP 抑制肽合成采用 FMOC 固相合成法成功合成具有 LBP 的 91-102 位氨基酸序列的多肽WKVRKSFFKLQG-NH2，并在其 C 端加 NH2修飾以增強其穩(wěn)定性。合成后的粗肽經(jīng)過脫鹽后進行反向 HPLC 純化，純度超過 95%。得到的多肽純品進行質譜分析測定分子量為 1523.6，與理論值相符，說明合成的多肽結構正確，純度合乎測試要求，可用于生物學活性的檢測與評價。合成肽的質譜圖見圖 35，色譜圖見圖 36。

圖 36 LBP 抑制肽 HPLC 色譜圖Fig36 The HPLC cromatogram of LBP inhibitor peptide2. LBP 抑制肽的生物學活性鑒定（1）不同濃度 LBP 抑制肽對 LBP 增強 LPS 誘導 PBMC 分泌 TNFα的抑制研究發(fā)現(xiàn) PBMC+rhLBP 組、PBMC+20μM peptide 組、PBMC+rhLBP+2ide 組與 PBMC 組之間 TNFα含量差別不顯著（P㧐0.05），表明 rhLBP 和 L均無直接增強或抑制 LPS 致炎作用；PBMC+LPS 組 TNFα含量顯著高于 PP㩳0.01），PBMC+LPS+LBP 組 TNFα含量顯著高于 PBMC+LPS 組（P㩳0.01BP 具有增敏 LPS 致炎作用； 0.02μM 抑制肽使 LBP 增敏 LPS 誘導 PBMCα有下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異（P㧐0.05）； 而 0.2μM 抑制肽即有顯著抑P㩳0.05），這個濃度為 LBP 抑制肽顯著抑制 10ng/ml LBP 增強 10ng/ml LPS

PBMC空白對照的流式細胞分析

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