【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染仍為全球重要健康問(wèn)題之一,大約有3億5千萬(wàn)慢性感染人口,每年死于HBV感染的人數(shù)達(dá)1百萬(wàn)。我國(guó)HBV感染人群比例更大,估計(jì)占總?cè)丝诘?0%。HBV感染可出現(xiàn)多種臨床表現(xiàn),包括急性、慢性、重型肝炎,可發(fā)展為肝硬化、肝癌,最終常因肝衰竭而死亡。上述復(fù)雜疾病譜的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,目前一致認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制中免疫反應(yīng)占主導(dǎo)地位,受MHC-Ⅰ類分子嚴(yán)格限制的抗原特異性CTL識(shí)別感染肝細(xì)胞是造成肝損傷的主要原因,抗原特異性CTL在HBV感染發(fā)病中具有重要作用。 對(duì)HBV感染免疫發(fā)病機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),HBV感染時(shí)抗原特異性CTL反應(yīng)很弱,特別是慢性HBV感染,用傳統(tǒng)檢測(cè)抗原特異性CTL的方法,如有限稀釋法(limiting dilution assays,LDA)、~(51)Cr釋放試驗(yàn)法、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法等方法幾乎檢測(cè)不到,這種情況嚴(yán)重阻礙了HBV感染抗原特異性CTL的研究。自從1996年Altman等發(fā)明了MHC-表位肽四聚體技術(shù)以來(lái),四聚體技術(shù)已經(jīng)廣泛用于基礎(chǔ)和臨床研究,也推動(dòng)了HBV感染抗原特異性CTL的研究。四聚體技術(shù)直接檢測(cè)抗原特異性CTL,無(wú)需體外擴(kuò)增,是一種高效敏感的方法。 四聚體復(fù)合物是用生物技術(shù)將MHC-Ⅰ分子的C末端接一個(gè)生物素化位點(diǎn),然后與特異性表位肽結(jié)合為MHC-Ⅰ抗原肽復(fù)合物,再按照4∶1的比例結(jié)合在親和素上成為MHC-Ⅰ四聚體復(fù)合物。四聚體復(fù)合物可同時(shí)識(shí)別針對(duì)這段表位肽的四個(gè)T細(xì)胞受體(T cell antigen receptor,TCR),與T細(xì)胞緊密結(jié)合,從而識(shí)別特異性CTL。四聚體技術(shù)具有很強(qiáng)的通用性,即相同的MHC表型個(gè)體之間,四聚體復(fù)合物可以通用,無(wú)需考慮T細(xì)胞受體的多樣性。另一方面,四聚體復(fù)合物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,對(duì)適用于相同MHC表型個(gè)體的各種四聚體復(fù)合物之間的差異僅在所采用的表位肽。因此,構(gòu)建一個(gè)MHC-表位肽四聚體也就方便了其他肽特異性四聚體復(fù)合物的構(gòu)建。 四聚體技術(shù)用于HBV感染抗原特異性CTL的研究已有幾年,但多限于核心抗原18-27、衣殼抗原335-343和多聚酶抗原575-583,而且所采用的病例數(shù)較少,難以反映HBV感染抗原特異性CTL的真實(shí)狀態(tài)。因此,更多病例,更多抗原表位肽特異性
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

等很難檢測(cè)到，因而限制了HBV特異性細(xì)胞免疫的深入研究。對(duì)HBV感染患者特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞數(shù)量低的原因有多種推測(cè)，均未得到有效證實(shí)。同時(shí)，人逐漸認(rèn)識(shí)到這些傳統(tǒng)方法的一個(gè)共同點(diǎn)是采用體外活化的方法進(jìn)行抗原特異TL的研究，它們只能檢測(cè)到具有增殖、活化潛力的T細(xì)胞，因而肯定低估了抗原性CTL水平[’4]，改進(jìn)檢測(cè)方法將有助于抗原特異性CTL的研究。1996年Altman等I‘’]建立可溶性甩A一般膚四聚體復(fù)合物(tetrmaericeo帥lexes，arme)r法，為抗原特異性CTL的研究開拓了新的天地�？扇苄訦LA一A2膚四聚體物是通過(guò)基因工程技術(shù)將巧個(gè)氨基酸的BiAr酶底物膚B(SP)的編碼基因克隆到質(zhì)HLA一A2重鏈梭基端，表達(dá)HLA一A2重鏈一BSP融合蛋白。將融合蛋白、p一2微白、抗原表位膚(體外合成)折疊復(fù)合后與BirA酶作用，產(chǎn)生賴氨酸殘基，再與藻白(PE)標(biāo)記的親合素混合，形成HL-AAZ重鏈、藻紅蛋白一親合素、p一2微球蛋白、位膚組成的四價(jià)復(fù)合體，四聚體復(fù)合物可以同時(shí)與四個(gè)TCR結(jié)合。四聚體復(fù)合物仿CTL識(shí)別靶細(xì)胞的“雙識(shí)別”過(guò)程與TCR相結(jié)合，從而標(biāo)記該IILA型、特定表位的CTL細(xì)胞。

PCR擴(kuò)增HAL一A2一BSP基因片段，片段大約30b7p子量標(biāo)準(zhǔn)條帶，從下到上為:100Pb、200bP、300bp、400bp、500Pb、600p一微球蛋白M圖1一4p一2微球蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌PCR鑒定結(jié)果

達(dá)質(zhì)粒和p一2微球蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)時(shí)間最長(zhǎng)達(dá)36小時(shí)�！筂109轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌培養(yǎng)皿中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，BLZID(E3)、BLZI(DE3)pLyss轉(zhuǎn)化成功，但生長(zhǎng)緩慢，在24小時(shí)左右才能看見(jiàn)。見(jiàn)圖1一2(培養(yǎng)30小時(shí))二、HL-AAZ一SP表達(dá)質(zhì)粒和p一2微球蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌的鑒定1.挑取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌在含氨節(jié)青霉素LB培養(yǎng)液中，37℃搖菌培養(yǎng)，培養(yǎng)液剛開始變渾濁時(shí)，取菌液進(jìn)行PCR方法直接鑒定轉(zhuǎn)化菌液，PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖電泳，見(jiàn)預(yù)計(jì)大小的陽(yáng)性條帶者為轉(zhuǎn)化成功細(xì)菌。轉(zhuǎn)化成功細(xì)菌PCR鑒定電泳結(jié)果見(jiàn)圖l一3。

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本文編號(hào)：2776656