【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染仍為全球重要健康問題之一,大約有3億5千萬慢性感染人口,每年死于HBV感染的人數(shù)達1百萬。我國HBV感染人群比例更大,估計占總人口的10%。HBV感染可出現(xiàn)多種臨床表現(xiàn),包括急性、慢性、重型肝炎,可發(fā)展為肝硬化、肝癌,最終常因肝衰竭而死亡。上述復雜疾病譜的發(fā)病機制尚不清楚,目前一致認為其發(fā)病機制中免疫反應占主導地位,受MHC-Ⅰ類分子嚴格限制的抗原特異性CTL識別感染肝細胞是造成肝損傷的主要原因,抗原特異性CTL在HBV感染發(fā)病中具有重要作用。 對HBV感染免疫發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn),HBV感染時抗原特異性CTL反應很弱,特別是慢性HBV感染,用傳統(tǒng)檢測抗原特異性CTL的方法,如有限稀釋法(limiting dilution assays,LDA)、~(51)Cr釋放試驗法、酶聯(lián)免疫斑點法等方法幾乎檢測不到,這種情況嚴重阻礙了HBV感染抗原特異性CTL的研究。自從1996年Altman等發(fā)明了MHC-表位肽四聚體技術以來,四聚體技術已經(jīng)廣泛用于基礎和臨床研究,也推動了HBV感染抗原特異性CTL的研究。四聚體技術直接檢測抗原特異性CTL,無需體外擴增,是一種高效敏感的方法。 四聚體復合物是用生物技術將MHC-Ⅰ分子的C末端接一個生物素化位點,然后與特異性表位肽結合為MHC-Ⅰ抗原肽復合物,再按照4∶1的比例結合在親和素上成為MHC-Ⅰ四聚體復合物。四聚體復合物可同時識別針對這段表位肽的四個T細胞受體(T cell antigen receptor,TCR),與T細胞緊密結合,從而識別特異性CTL。四聚體技術具有很強的通用性,即相同的MHC表型個體之間,四聚體復合物可以通用,無需考慮T細胞受體的多樣性。另一方面,四聚體復合物結構簡單,對適用于相同MHC表型個體的各種四聚體復合物之間的差異僅在所采用的表位肽。因此,構建一個MHC-表位肽四聚體也就方便了其他肽特異性四聚體復合物的構建。 四聚體技術用于HBV感染抗原特異性CTL的研究已有幾年,但多限于核心抗原18-27、衣殼抗原335-343和多聚酶抗原575-583,而且所采用的病例數(shù)較少,難以反映HBV感染抗原特異性CTL的真實狀態(tài)。因此,更多病例,更多抗原表位肽特異性
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392
【圖文】：

等很難檢測到，因而限制了HBV特異性細胞免疫的深入研究。對HBV感染患者特異性細胞毒性T細胞數(shù)量低的原因有多種推測，均未得到有效證實。同時，人逐漸認識到這些傳統(tǒng)方法的一個共同點是采用體外活化的方法進行抗原特異TL的研究，它們只能檢測到具有增殖、活化潛力的T細胞，因而肯定低估了抗原性CTL水平[’4]，改進檢測方法將有助于抗原特異性CTL的研究。1996年Altman等I‘’]建立可溶性甩A一般膚四聚體復合物(tetrmaericeo帥lexes，arme)r法，為抗原特異性CTL的研究開拓了新的天地�？扇苄訦LA一A2膚四聚體物是通過基因工程技術將巧個氨基酸的BiAr酶底物膚B(SP)的編碼基因克隆到質(zhì)HLA一A2重鏈梭基端，表達HLA一A2重鏈一BSP融合蛋白。將融合蛋白、p一2微白、抗原表位膚(體外合成)折疊復合后與BirA酶作用，產(chǎn)生賴氨酸殘基，再與藻白(PE)標記的親合素混合，形成HL-AAZ重鏈、藻紅蛋白一親合素、p一2微球蛋白、位膚組成的四價復合體，四聚體復合物可以同時與四個TCR結合。四聚體復合物仿CTL識別靶細胞的“雙識別”過程與TCR相結合，從而標記該IILA型、特定表位的CTL細胞。

PCR擴增HAL一A2一BSP基因片段，片段大約30b7p子量標準條帶，從下到上為:100Pb、200bP、300bp、400bp、500Pb、600p一微球蛋白M圖1一4p一2微球蛋白表達質(zhì)粒轉化細菌PCR鑒定結果

達質(zhì)粒和p一2微球蛋白質(zhì)粒轉化感受態(tài)細菌，培養(yǎng)時間最長達36小時。」M109轉化感受態(tài)細菌培養(yǎng)皿中無細菌生長，BLZID(E3)、BLZI(DE3)pLyss轉化成功，但生長緩慢，在24小時左右才能看見。見圖1一2(培養(yǎng)30小時)二、HL-AAZ一SP表達質(zhì)粒和p一2微球蛋白質(zhì)粒轉化感受態(tài)細菌的鑒定1.挑取質(zhì)粒轉化感受態(tài)細菌在含氨節(jié)青霉素LB培養(yǎng)液中，37℃搖菌培養(yǎng)，培養(yǎng)液剛開始變渾濁時，取菌液進行PCR方法直接鑒定轉化菌液，PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖電泳，見預計大小的陽性條帶者為轉化成功細菌。轉化成功細菌PCR鑒定電泳結果見圖l一3。

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