【摘要】：噬菌體抗體庫技術(shù)為人抗體的制備提供了強(qiáng)有力的手段，是近年來抗體技術(shù)中的革命性進(jìn)展。我們用經(jīng)肝癌細(xì)胞體外免疫的淋巴細(xì)胞構(gòu)建了表面表達(dá)Fab的人源性噬菌體抗體庫，并篩選出兩個(gè)特異性與肝癌細(xì)胞結(jié)合而不與正常肝細(xì)胞結(jié)合的Fab噬菌體克隆。 淋巴細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng) 淋巴細(xì)胞來源于13例原發(fā)性肝癌病人外周血單個(gè)核細(xì)胞和一例肝癌病人的腫瘤引流區(qū)淋巴結(jié)。分離得到的淋巴細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含有IL-2，PWM和LPS。肝癌細(xì)胞系SMMC-7721用細(xì)胞固定液固定或經(jīng)。~(60)Co照射后，加入淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中，進(jìn)行體外免疫。培養(yǎng)7天后出現(xiàn)胞體增大的淋巴母細(xì)胞并可見克隆性增生。 人Fab抗體庫的構(gòu)建 從體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞中提取總RNA，并用一套引物逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增出7種Fd基因(γ)和9種全長輕鏈基因(6λ，3κ)。通過將輕鏈基因和重鏈Fd基因插入噬菌體表達(dá)載體pComb3并經(jīng)輔助噬菌體VCSM13超感染，構(gòu)建了人Fab組合抗體庫。用羊抗人IgG Fab和HRP-羊抗人IgG Fab進(jìn)行夾心ELISA檢測，可以鑒定噬菌體表達(dá)Fab的情況。 抗體庫的篩選 將抗體庫與肝癌細(xì)胞系SMMC-7721孵育，結(jié)合的噬菌體用Ph2.2的洗脫緩沖液洗脫，并感染XL1-Blu進(jìn)行增殖。為了提高肝癌特異性結(jié)合的噬菌體并降低無關(guān)噬菌體的結(jié)合，我們采用了競爭篩選方法。首先將抗體庫與肝癌細(xì)胞結(jié)合，然后稀釋到過量的正常肝細(xì)胞懸液中，
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：1999
【分類號(hào)】：R735.7;R392
【圖文】：

巾拳二壬二巴學(xué)忿毛立示侖用淋巴結(jié)來源的CDNA為模板，上述基因中有的沒Fd基因中，擴(kuò)增出vHlf，vHZ一4f，vHla，VH3a;Fd基因用混合的上游引物擴(kuò)增出弱陽性;基因中擴(kuò)增出VLZ，VL3，VL4，VLS，VK抓。7依次為:VHlf，VHZ一4fM:f，(’RMa丈、ker(237，377VH3f，VH6f，VHla，VH:〕a，515，697，994，154:弓)

依次為:VHlf，VHZ一4f:f，(’RMa丈、ker(237，377VH3f，VH6f，VHla，VH:515，697，994，154:弓)圖3PC尺擴(kuò)增人工g(1i輕鏈基因依次為:vLI，vLZ，vL3，vL4，vLS，vL6，M:Pc

圖8單個(gè)噬菌體克隆與肝癌細(xì)胞結(jié)合活性的EL工AS結(jié)果(F7和HI為PBS陰性對(duì)照)正常肝細(xì)胞結(jié)合ELIAS將上述陽性克隆中D0值較高的37個(gè)克隆，進(jìn)行正常肝檢測，同時(shí)做肝癌細(xì)胞結(jié)合ELIAS作為平行對(duì)照。結(jié)果:肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞兩者都結(jié)合，只有6個(gè)克隆不合。這些克隆分別是:A6(32)，Bzo(69)，el(70)，eZ(CS(83)。圖9單個(gè)噬菌體克隆與肝癌細(xì)胞結(jié)合活性的ELIAS結(jié)果(DS一10為PBS陰性對(duì)照)

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 柳鵬程;喬涵;劉斐斐;劉畢勝;吳倩妮;張燕燕;單金玉;魏蓮花;馬興銘;;噬菌體作為模式生物在蛋白表達(dá)和病毒學(xué)方面的應(yīng)用[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2012年05期

本文編號(hào)：2776563