【摘要】：骨缺損(bone defect)、尤其是長(zhǎng)段骨缺損一直是骨科界的難題之一。迄今為止臨床上對(duì)因創(chuàng)傷、感染和腫瘤切除后所造成的長(zhǎng)段骨缺損的修復(fù)仍未得到有效的解決。傳統(tǒng)的移植方式主要有自體骨移植和異體骨移植，但自體骨移植面臨著骨源受限、增加創(chuàng)傷和感染率等缺陷，而異體骨移植存在生物活性差、免疫排斥反應(yīng)和傳播疾病的危險(xiǎn)。上世紀(jì)九十年代開(kāi)始，研究者將更多的注意力放在了組織工程骨的開(kāi)發(fā)和研究上。其基本方法是將體外培養(yǎng)的種子細(xì)胞種植在具有生物相容性和可降解性的天然或者人工合成的細(xì)胞外基質(zhì)上，然后將此細(xì)胞．支架材料復(fù)合物植到體內(nèi)，以誘發(fā)所希望的細(xì)胞響應(yīng)(粘附、分化和增殖等)。目前，骨組織工程的研究主要集中于種子細(xì)胞的研究、支架材料的研制和組織工程化人工骨對(duì)骨缺損的修復(fù)。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有自我更新和復(fù)制能力的成體干細(xì)胞，具有明確的成骨分化潛能，易于獲得及擴(kuò)增，其獨(dú)特的細(xì)胞增殖分裂模式使外源基因易于導(dǎo)入和表達(dá)，因此成為目前研究最廣泛的組織工程骨種子細(xì)胞。與骨膜源成骨細(xì)胞等其它種子細(xì)胞相比，MSCs具有取材方便、對(duì)供體部位損傷小等優(yōu)點(diǎn)，臨床應(yīng)用前景更廣闊。MSCs在條件培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下可以體外分化為成骨細(xì)胞，盡管已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，多種生長(zhǎng)因子如骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、成骨因子1(osteogenic protein-1，OP-1)等能促進(jìn)MSCs的成骨分化，然而如何使MSCs進(jìn)行定向誘導(dǎo)成骨分化，從而更好的應(yīng)用于骨組織工程是我們亟待解決的問(wèn)題。 Cbfal是成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，成體中僅在成骨細(xì)胞和骨組織表達(dá)；胚胎發(fā)育過(guò)程中，Cbfal在間充質(zhì)細(xì)胞凝聚區(qū)高表達(dá)�；蚯贸笞C明Cbfal對(duì)成骨細(xì)胞分化和骨形成具有重要作用。利用Cbfal對(duì)MSCs進(jìn)行基因修飾，是否可以達(dá)到定向成骨誘導(dǎo)分化的效應(yīng)?本實(shí)驗(yàn)圍繞這一中心展開(kāi)研究。 本實(shí)驗(yàn)在成功構(gòu)建Cbfal重組腺病毒和分離培養(yǎng)純化MSCs的基礎(chǔ)上，檢測(cè)了Cbfal對(duì)MSCs的成骨定向分化作用，并利用改良設(shè)計(jì)的流動(dòng)腔灌流裝置，對(duì)Cbfal基因修飾MSCs與脫細(xì)胞骨基質(zhì)復(fù)合后動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，觀察了所構(gòu)建的組織工程化骨對(duì)兔橈骨大段骨缺損的修復(fù)效應(yīng)，并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行了初步探討，其主要結(jié)果如下： 第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 1.首先利用基因同源重組原理，通過(guò)pAdEasy腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建了Cbfal重組腺病 毒，以及對(duì)照病毒pAdEasy一GFP一gal。并通過(guò)GFP熒光表達(dá)、PCR等方法證明目的基 因存在于所構(gòu)建載體中。病毒純化后病毒滴度達(dá)1.6x 10’2，NIH3T3細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)顯 示，Cbfal腺病毒能有效的介導(dǎo)Cbfal的表達(dá)。 2.利用Cbfal重組腺病毒轉(zhuǎn)染MSCs，經(jīng)蛋白印跡、免疫組化、熒光觀察等證實(shí) 了Cbfal目的基因在MSCs中的表達(dá)。同時(shí)利用RT一PCR、對(duì)硝基苯磷酸二鈉法和放 免法檢測(cè)成骨細(xì)胞標(biāo)志基因ALP、OCN、OPN、I型膠原表達(dá)及BMP一2、MyoD、PPAR YZ、OPG等基因表達(dá)，結(jié)果Cbfal可以提高除I型膠原外大部分成骨細(xì)胞標(biāo)志基因 的表達(dá)，ALP活性和OCN含量明顯提高，而成脂、成肌方向分化明顯抑制，骨礦化 小結(jié)計(jì)數(shù)明顯增多，表明Cbfal基因修飾可以促進(jìn)MSCs的成骨定向分化。 3.對(duì)云南版納小型豬近交系的骨組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理，獲得脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料， 經(jīng)組織學(xué)染色、SEM觀察、異種抗原檢測(cè)和生物力學(xué)檢測(cè)表明該基質(zhì)材料在去除細(xì)胞 成分的基礎(chǔ)上，消除了抗原性，保留骨細(xì)胞外基質(zhì)的生理結(jié)構(gòu)，為種子細(xì)胞的種植提 供了良好的空間結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)環(huán)境。細(xì)胞種植在該材料上后，細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)不受抑 制，可以正常的粘附、伸展及分化。因此本實(shí)驗(yàn)制備的脫細(xì)胞骨基質(zhì)具有良好的細(xì)胞相 容性、骨誘導(dǎo)性和力學(xué)特性，是一種較理想的支架材料。 4.改良設(shè)計(jì)一種新型的流動(dòng)腔灌流體系，實(shí)現(xiàn)種子細(xì)胞的動(dòng)態(tài)種植和體外培養(yǎng)。 檢測(cè)培養(yǎng)7d后ALP活性和OCN含量，顯示流動(dòng)腔組明顯高于靜態(tài)培養(yǎng)組，而Cbfal 組明顯高于對(duì)應(yīng)的對(duì)照組。表明Cbfal作為流體力學(xué)刺激的靶基因，進(jìn)一步促進(jìn)了 MSCs的定向分化:也證明了我們改良設(shè)計(jì)的流動(dòng)腔灌流裝置是一種簡(jiǎn)便易控、有效 的生物反應(yīng)器。 5.建立兔撓骨1.2cm骨缺損，分別以材料一Cbfal基因修飾細(xì)胞、材料一未修飾細(xì)胞、 單純材料和不作處理的空白對(duì)照進(jìn)行修復(fù)實(shí)驗(yàn)，在4w、sw、12w進(jìn)行X線檢查和組織 學(xué)觀察。結(jié)果表明空白組骨不連，單純材料組有少量新骨生成，材料一未修飾細(xì)胞組有較 多新骨生成，材料一基因修飾細(xì)胞組在12w得到了臨床治愈。 總之，本實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建了Cbfal重組腺病毒，并利用其轉(zhuǎn)染MSCs，使MSCs 在Cbfal的調(diào)控下成骨定向分化;制備了版納小型豬的脫細(xì)胞骨基質(zhì)，以此為支架材 料，對(duì)Cbfal基因修飾的MSCs進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，明顯促進(jìn)了細(xì)胞的成骨分化;并觀察 了所構(gòu)建的組織工程化骨對(duì)骨缺損的修復(fù)作用，旨在為骨缺損的治療提供新的思路， 為干細(xì)胞組織工程的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R329

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