【摘要】：蚊可傳播多種疾病,如瘧疾、登革熱等,嚴(yán)重危害人類健康。蚊媒控制一直是蚊媒病防治的重要手段。殺蟲劑化學(xué)防制因其高效、速效、成本低廉、使用簡便,成為蚊媒病防治的主要措施。然而長期大量地使用殺蟲劑,導(dǎo)致蚊媒抗藥性的發(fā)生和發(fā)展,蚊媒病防治效果不斷下降,新發(fā)和重現(xiàn)的蚊媒病不斷發(fā)生�？顾幮砸呀�(jīng)成為蚊媒病防治工作中的最大障礙。蚊抗藥性機(jī)制研究成為全球蚊媒防制研究的重點(diǎn)課題。 本研究以我國分布廣、種群密度高、實(shí)驗(yàn)室易于馴化飼養(yǎng)的重要家棲性病媒——淡色庫蚊為研究對象,于山東唐口地區(qū)采集淡色庫蚊自然種群,以當(dāng)前使用最為廣泛的溴氰菊酯逐代篩選建立抗性種群,動(dòng)態(tài)監(jiān)測不同殺蟲劑選擇壓力下種群抗藥性的發(fā)展規(guī)律,采用大樣本的單蚊同時(shí)檢測靶標(biāo)抗性kdr和代謝抗性3大解毒酶系,揭示靶標(biāo)抗性和代謝抗性在不同選擇壓力下抗藥性變化規(guī)律,探索蚊抗藥性的遺傳進(jìn)化機(jī)制。 本研究的主要結(jié)果如下： 1.不同選擇壓力種群的篩選 以溴氰菊酯篩選淡色庫蚊自然種群,實(shí)驗(yàn)篩選30代,歷時(shí)28個(gè)月,成功建立3個(gè)不同選擇壓力作用下的種群：篩選組,以LC50濃度篩選,每代死亡率約50-60%；維持組,以第6代LC50濃度維持篩選,死亡率逐代降低,由50%降低到小于5%；停藥組,于第6代后停止殺蟲劑篩選。研究結(jié)果為抗藥性遺傳進(jìn)化和生物系統(tǒng)進(jìn)化及適應(yīng)研究提供了良好的模型和材料。 2.動(dòng)態(tài)監(jiān)測不同選擇壓力下種群抗藥性的發(fā)展規(guī)律 篩選組抗性水平逐代升高,至第30代種群LC5o上升到0.9713mg/L,抗性水平顯著增高(p0.001),抗性系數(shù)為47.15。維持組抗性水平亦逐代升高,趨勢較篩選組緩慢,至第30代種群LC50上升到0.4367mg/L,抗性水平顯著增高(p0.001),抗性系數(shù)為21.20。停藥組抗性水平逐代降低,從第6代到第30代,抗性水平LC50由0.0501mg/L降低到0.0241mg/L,抗性系數(shù)由2.43降低到1.17,抗性水平顯著降低(p0.001),但仍高于第一代(LC50=0.0206mg/L)。以上結(jié)果表明,種群在長期接觸擬除蟲菊酯類殺蟲劑后,抗藥性顯著增高,抗性發(fā)展的速度與殺蟲劑選擇壓密切相關(guān),殺蟲劑的選擇壓力越高,抗性程度發(fā)展越快。種群對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性不穩(wěn)定,停用殺蟲劑可使抗性下降,但抗性衰退趨勢十分緩慢,停用時(shí)間必須維持一個(gè)相對長的時(shí)間。此外,種群長期接觸低劑量殺蟲劑亦會(huì)導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生。如維持組以恒定低劑量的溴氰菊酯篩選,其抗性水平亦隨時(shí)間而增加,雖然趨勢較篩選組緩慢,但至第30代抗性水平上升了21.20倍。 3.單蚊同時(shí)檢測不同選擇壓力下種群靶標(biāo)抗性和代謝抗性的變化規(guī)律 實(shí)驗(yàn)共檢測3000份單蚊樣本,由于序列測定及酶活性檢測過程中部分樣本未有結(jié)果,最終我們成功測序樣本為2427份,成功檢測P450s、ESTs和GSTs樣本分別為1541、1368和1665份。 篩選組中,靶標(biāo)抗性kdr基因頻率變化為：等位基因L1014F的頻率逐代增高,至第14代頻率增加到100%,14代后種群成為kdr抗性基因純合群體；等位基因L1014和L1014S的頻率逐代降低。代謝抗性酶活性變化為：種群單加氧酶活性隨種群抗性水平的升高而逐代增高,至第30代約增加2.20倍,14代后種群單加氧酶活性呈現(xiàn)顯著增加趨勢；種群羧酸酯酶活性隨種群抗性水平的升高而逐代增高,至第30代約增加1.55倍,活性增加趨勢較平穩(wěn),第14代后酶活性增加趨勢顯著；谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶活性與種群抗性水平無相關(guān)性。 維持組中,靶標(biāo)抗性kdr基因頻率變化為：等位基因L1014F的頻率逐代增高,至第26代頻率增加到100%,26代后種群成為kdr抗性基因純合群體；等位基因L1014和L1014S的頻率逐代降低。代謝抗性酶活性變化為：種群單加氧酶活性亦隨種群抗性水平的升高而逐代增高,但增加趨勢較篩選組緩慢,至第30代約增加1.62倍,26代后種群單加氧酶活性呈現(xiàn)顯著增加趨勢：種群羧酸酯酶活性亦隨種群抗性水平的升高而逐代增高,但增加趨勢較篩選組緩慢,至第30代約增加1.15倍,增加趨勢緩慢平穩(wěn)；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性與種群抗性水平無相關(guān)性。 停藥組中,靶標(biāo)抗性kdr基因頻率變化為：等位基因L1014F的頻率逐代降低,第6代為91.79%,至第30代頻率減少到82.27%,但仍顯著高于第1代(72.64%)；等位基因L1014S的頻率逐代升高。代謝抗性酶活性變化為：種群單加氧酶活性隨種群抗性水平的降低而逐代減少,至第30代約減少0.81倍；種群羧酸酯酶活性隨種群抗性水平的降低而逐代減少,至第30代約減少0.59倍；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性與種群抗性水平無相關(guān)性。 以上不同選擇壓力下,靶標(biāo)抗性kdr基因頻率、代謝抗性酶活性變化與抗性水平關(guān)系分析表明：等位基因L1014F與抗性表型呈正相關(guān),其頻率隨抗性水平的升高而增加,且增加的速率與選擇壓力相關(guān)。單加氧酶與羧酸酯酶活性的增加,是代謝抗性產(chǎn)生的主要原因,其中以單加氧酶活性增加為主要因素。表明kdr、單加氧酶與非專一性酯酶可望一同作為現(xiàn)場抗藥性檢測的分子靶標(biāo)。代謝抗性和靶標(biāo)抗性共同參與種群抗藥性,在抗藥性早期,靶標(biāo)抗性發(fā)揮主導(dǎo)作用；當(dāng)抗藥性進(jìn)化到一定階段后,代謝抗性開始發(fā)揮主導(dǎo)地位,抗性水平出現(xiàn)顯著上升。殺蟲劑選擇壓力對兩種抗性機(jī)制選擇力度不同,是導(dǎo)致兩種機(jī)制先后發(fā)揮作用的主要因素。去除殺蟲劑選擇壓力后,代謝抗性相對靶標(biāo)抗性衰退顯著,提示代謝抗性適應(yīng)度代價(jià)相對靶標(biāo)抗性較高,在殺蟲劑選擇壓力下,具有靶標(biāo)抗性的個(gè)體被優(yōu)先選擇下來。 對于抗藥性是否還與鈉離子通道基因其他位點(diǎn)突變有關(guān),解毒酶家族成員在抗性中的作用及其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。 本研究以蚊自然種群為研究對象,對不同選擇壓力下種群抗藥性發(fā)展進(jìn)行了30代動(dòng)態(tài)檢測,采用大樣本的單蚊同時(shí)檢測種群靶標(biāo)抗性kdr和代謝抗性3大解毒酶系在不同選擇壓力下的變化,初步探討蚊抗藥性的遺傳進(jìn)化規(guī)律,研究結(jié)果可望為殺蟲劑的合理使用、抗藥性機(jī)制研究、抗藥性的檢測和治理提供科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R384.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 阮成龍;米智;朱勇;;昆蟲抗藥性機(jī)制研究進(jìn)展[J];蠶業(yè)科學(xué);2012年02期

2 王靖,袁家s

本文編號(hào)：2771332